Rotor gene q инструкция по эксплуатации на русском

Термоциклер

Rotor—Gene^ТМ
6000

для
проведения ПЦР с детекцией

в
режиме «реального времени»

РУКОВОДСТВО
ПОЛЬЗОВАТЕЛЯ

Технические
характеристики прибора Rotor-Gene
6000 6

1. Введение 7

Поддержка
пользователей 7

2. Описание
Rotor-Gene 8

2.1
Принципы работы системы 8

2.2
Система термоциклирования 9

2.3
Оптическая система мультиканальной
детекции 12

Схема
оптической системы 13

Описание
каналов 14

2.4
Типы роторов 15

3.
Элементы прибора и комплектующие 17

3.1
Распаковка прибора 17

3.2
Дополнительные принадлежности
прибора 18

3.3
Прочтите перед работой с прибором
21

4.
Установка и обслуживание 23

4.1
Установка прибора 23

4.2
Обслуживание системы 24

4.3
Установка и обновление программы 25

Установка
программы 25

Версия
программы 27

Обновление
версии программы 28

Что
нового в программе? 28

5.
Подготовка
к проведению анализа 30

1. Подготовка
   пробирок с реакционной смесью 30

2. Подготовка
   Gene-Disc 32

3. Включение
   прибора Rotor-Gene 35

6.
Запуск Анализа. Мастер Старта и
Шаблоны 35

1. Мастер
   быстрого старта / Quick Start Wizard 36

Выбор
типа ротора 36

Подтверждение
профиля термоциклирования 37

Сохранение
анализа 37

Таблица
образцов 38

1. Детальный
   Мастер / Advanced Wizard 39
   Мастер Детальной
   установки параметров 39

Первое
окно: выбор ротора 39

Второе
окно 40

Третье
окно: редактор профиля и установки
каналов 41

Четвертое
окно: параметры перед стартом 42

Пятое окно: Редактор образцов 43

2

1. Редактирование
   профиля / Edit
   Profile
   43

Окно
Edit Profile 43

Блок
Циклирования / Cycling
44

Детекция
/ Acquisition 46

Удерживание
температуры / Hold 48

Плавление/Гибридизация
/ Melt/Hybridisation 48

Плавление
с высоким разрешением / HRM 49

Оптическая
денатурация / Optical
Denature
49

1. Авто-Оптимизация
   параметра
   «Gain»/Ручная
   настройка «Gain» 51

2. Редактирование
   таблицы образцов / Edit
   Samples

Типы
образцов

Стандартный
и роторный вид редактора образцов

Группы
образцов

1. Обзор
   основных функций 55

   1. Рабочее
      пространство экрана 55

   2. Панель
      инструментов 56

   3. Обзор
      необработанных данныx
      по каналам 56

7.4
Включение / выключение образцов 58

7.5
Меню Файлов / File 59

Новый/New 59

Открыть
файл, сохранить файл 59

Опция
Reports…
(Отчеты) 61

Опция
Setup…
(Установки) 61

8.
Меню Анализа данных / Analysis 62

8.1
Панель инструментов меню Analysis
(Анализ) 62

8.2
Количественный анализ / Quantitation
63

Основное
окно 64

Кривая
Стандартов / Standard curve 66

Расчет
кривой стандартов 68

Порог
/
Threshold 69

Импорт
Кривой Стандартов 70

Таблица
Результатов / Results 71

Основные
опции обработки данных меню Quantitation 72

Dynamic
Tube / Динамический
фон пробирки 73

Slope
Correct /
Коррекция наклона 73

Ignore
First /
Пренебречь первыми 73

Quantitate
Settings / Установки
Количественного анализа 73

Наклон,
Амплификация, Эффективность Реакции 74

Шаблон
Количественного Анализа данных 76

8.3
Относительный Количественный Анализ
по Двум Кривым Стандартов 76

8.4
Аллельное Распознавание
/ Allelic
Discrimination 79

8.5
Анализ кривых плавления / Melt Curve
Analysis 82

Бины 83

Результаты.
Отчеты . 84

Генотипы 84

Шаблон
Анализа данных кривых плавления Melt 85

1. Плавления
   Высокого Разрешения / High
   Resolution
   Melt
   (HRM) 85

2. Анализ
   Распределения / Scatter
   Graph
   Analysis 86

3. Анализ
   по Конечной Точке / EndPoint
   Analysis 89

Термины,
используемые при Анализе по Конечной
Точке 89

Основное
окно 89

Конфигурация
профиля 91

Определение
Pos/Neg
контролей 92

Нормализация 93

Порог
— Threshold 96

Генотипирование 96

Шаблон
анализа EndPoint 97

1. Относительный
   Количественный анализ Дельта-дельта
   Ct 99

2. Сравнительный
   количественный анализ / Comparative
   Quantitation

3. Измерение
   концентрации ДНК / Concentration
   Measurement

1. Обзор
   основных функций (часть 2) 97

9.1
Меню Run
(Запуск) 97

Старт 97

Пауза 97

Остановка
(прекращение работы) 97

9.2
Меню View
(Просмотр) 98

Установки
/ Settings

98

(общие
установки; установки прибора; сообщения;

установки
каналов; безопасность информации)

График
температуры / Temperature 102

Выполнение
профиля / Profile
progress
103

Редактор
Образцов / Samples
104

Опции
экрана 108

9.3
Меню Window
(Окно) 108

1. Меню
   Help (Помощь) 108

2. Меню
   Security
   (Безопасность информации)

10.
Общие функции, используемые несколькими
окнами 109

10.1 Шаблоны анализа
данных 109

10.2 Опция Открыть
Второй Анализ 110

10.3
Опции Масштабирования / Scale 110

10.4
Экспорт графиков и данных 111

10.5
Символ Гаечный Ключ 111

11.
Система Оптической Верификации
Температуры (OTV) 112

11.1
Функционирование
OTV-cистемы 112

11.2
Запуск
OTV-теста 113

12.
Сокращения 115

13.
Разрешение технических проблем и
вопросов 115

13.1
Log Archives (Файлы поиска и устранения
ошибок) 115

13.2.
Решение возможных проблем при проведении
анализа 116

Вопросы
– ответы (FAQs) 116

14
Математическое приложение 120

Технические
Характеристики

Характеристики	Значения
Емкость ротора	Три модификации: на 36 пробирок (0.2 мл); на 72 пробирки (0.1 мл, в стрипах по 4 штуки); блок «GeneDisc» на 72 или на 100 пробирок (дисковый планшет)
Диапазон рабочих температур	25 — 99С
Скорость изменения температуры (охлаждение/нагрев) потока воздуха	до 10,0С/сек.
Равномерность распределения температуры (от образца к образцу)	 0,01С
Разрешение (шаг) температуры	 0,02С
Источники возбуждения флуоресценции (высокоэнергетические светодиоды)	365( 20)nm, 470( 10)nm, 530( 5)nm, 585( 5)nm, 625( 10)nm, 680( 5)nm, 460( 15)nm – HRM
Детектирующие фильтры	460( 15) nm, 510( 5), 555( 5), 610( 5)nm, 660( 10)nm, 712 hp (hp-широкополосные)
Чувствительность фотоумножителя	От 5 нM раствора флуоресцеина
Используемые флуорофоры	Sybr Green I, FAM, TET, JOE, VIC, HEX, ROX, TAMRA, CY3, CY3.5, CY5, CY5.5, Oregon Green™, CAL Red™, Red 640, Texas Red
Габаритные размеры	высота – 275 мм ширина – 370 мм глубина – 420 мм, глубина c открытой крышкой – 560 мм
Напряжение питания	220 В (50 Гц)
Потребляемая мощность	не более 560 Вт
Масса	не более 14 кг
Минимальные требования к компьютеру	Pentium iV, 2 ГГц, 512 Mб RAM, HDD 10 Гб, свободный USB порт или COM порт 15″ монитор
Возможный объем реакционной смеси	От 5 до 50 мкл
Функция HRM: плавление с высоким разрешением	Опционально (при соответствующей конфигурации).
Функция Измерение концентрации ДНК	Позволяет напрямую измерять коцентрации нуклеиновых кислот, используя флуоресцентные красители (такие как PicoGreen®, RiboGreen® и др)

Rotor—Gene
6000
отвечает требованиям по электробезопасности
для оборудования I
класса по ГОСТ 12.2.025-76.

Для
обеспечения стабильности работы системы,
состоящей из термоциклера и компьютера,
рекомендуется использование источника
бесперебойного питания (ИБП) с максимальной
мощностью не менее 1 кВт и временем
поддержания напряжения питания, в случае
перебоев в электропитании, не менее 20
минут.

1. Введение

Добро
пожаловать в программу Rotor-Gene
6000
версии 1.7. Это справочное руководство
поможет пользователю в постановке
тестов или экспериментов и анализе
данных.

Система
для амплификации ДНК с детекцией в
режиме реального времени Rotor-Gene
является открытой платформой, позволяющей
использовать любой формат реагентов,
применяемых для такого рода анализа.
Программное обеспечение предоставляет
возможность проведения ПЦР-анализа с
использованием любого формата реакции
амплификации и анализа получаемых
данных.

Ознакомьтесь
с разделом «Что
нового в программе» чтобы
узнать об изменениях и новых функциях,
введенных в эту версию программы.

Поддержка
пользователей

Для
всех пользователей осуществляется
полная техническая и информационная
поддержка, включающая в себя профессиональный
и эффективный ответ на все возможные
вопросы и требования.

Пользователи
в России могут направлять свои запросы
по адресу:

ООО
«ИнтерЛабСервис»,

Москва,
105064, Б.Казенный пер., 10, стр. 3

Тел.:(495)
105 05 54 • Факс: (495) 916 18 18

Общий
Веб-сайт:

Главный
офис компании Corbett
Life
Science:

14
Hilly Street

Mortlake,
NSW, 2137

Australia

Телефон:
1800
803 915

T:
+61
(02) 9736 1320

F:
+61
(02) 9736 1364

E:
support@

E:
orders@
(NSW,
ACT, VIC, TAS, QLD and NT)

Возможные
конфигурации системы

Возможны
следующие варианты конфигурации системы
Rotor—Gene
6000:

Вариант
6200: 2
канала – Green, Yellow;

Вариант
62H0:
2
канала – Green,
Yellow
+ HRM
(с функцией Плавление высокого разрешения);

Вариант
6500: 5
каналов мультиплекс – Green, Yellow, Orange, Red,
Crimson;

Вариант
65H0: 5
каналов мультиплекс – Green, Yellow, Orange, Red,
Crimson
+
HRM
(с функцией Плавление высокого
разрешения);

Вариант
6600: 6
каналов мультиплекс – Blue, Green, Yellow,
Orange, Red, Crimson.

2. Описание Rotor-Gene

Rotor-Gene
6000
– это термоциклирующая система для
проведения полимеразной цепной реакции
(ПЦР)
в режиме реального времени (реал-тайм),
используемая для амплификации ДНК
и флуоресцентной детекции продуктов
амплификации. В конструкции Rotor-Gene
используется
инновационное решение — роторный
реакционный модуль.

Rotor-Gene 6000 позволяет
проводить амплификацию и детекцию с
последующим количественным анализом
содержания ДНК-мишени или (и) генотипированием
исследуемых образцов. Термоциклер
обеспечивает работу со всеми известными
форматами ПЦР
в режиме реального времени, включая
использование зондов с двойной меткой
(формат TaqMan,
формат
Molecular
Beacons и
др.),
FRET-анализ
и использование интеркалирующих
красителей (например, Sybr
Green I).
Rotor-Gene
6000 используется
для проведения исследований в различных
областях – в медицине, сельском хозяйстве,
а также фундаментальных исследований
в молекулярной биологии.

Надписи:
Камера
Ротора (реакционный модуль), Ручка
крышки, Воздушная вентиляция, Индикаторы
состояния прибора.

Мощное
и удобное, интуитивно понятное пользователю
программное обеспечение обеспечивает
простоту использования для начинающих
пользователей и при этом предоставляет
чрезвычайно широкие возможности. В
новой версии программы 1.7 интерфейс
стал еще более дружественным пользователю,
при этом обогащены возможности анализа
данных.

В
соединении с автоматической системой
для выделения и очистки нуклеиновых
кислот (Xtractor—Gene)
и системой автоматической подготовки
реакции (CAS1200),
Rotor-Gene
6000
может
быть интегрирован в полностью
автоматизированную систему для проведения
всех этапов ПЦР-анализа с детекцией в
режиме реального времени, обеспечивающую
высокую производительность и точность
при обработке образцов.

Xtractor-Gene

CAS1200

2.2. Система термоциклирования

В
приборе Rotor-Gene
6000
используется
сложная система нагревания-охлаждения,
обеспечивающая точное выполнение
заданного температурного режима
термоциклирования и оптимальные условия
реакции для эффективной амплификации
и детекции.

Температурные
характеристики:

• Диапазон
температур – до 99°С

• Точность
температуры ±0.2°С

• Разрешение
(шаг) температуры ±0.02°С

• Равномерность
температуры в образцах ±0.01°С

• Скорость
изменения температуры воздуха в камере
– 10°С/сек

Именно
глубоко продуманный роторный формат
реакционного модуля в Rotor-Gene
6000
обеспечивает
высокую точность получаемых данных за
счет максимальной равномерности
температуры для всех образцов, что
является ключевым моментом при проведении
ПЦР-анализа.

Ротор
с образцами постоянно вращается во
время анализа со скоростью 400 оборотов
в минуту. Такое центрифугирование не
создает градиента концентраций, не
мешает протеканию реакции, при этом
препятствует образованию конденсата
на крышках пробирок и устраняет пузырьки
воздуха, попавшие в раствор. Таким
образом, пробирки перед постановкой в
прибор нет необходимости центрифугировать.

Образцы
нагреваются и охлаждаются в потоке
воздуха, создаваемого воздушным
вентилятором. Нагревание воздуха
обеспечивается с помощью никель-хромового
элемента в крышке прибора. Охлаждение
реакционной камеры осуществляется
путем обдува воздухом, забираемым
снаружи снизу прибора, при этом воздух
находившийся до этого в камере выдувается
наружу через отверстия в верхней части
прибора.

Рисунок.
Схема
системы нагревания-охлаждения Rotor—Gene
6000

Воздушный
клапан закрывает камеру с содержащимся
в ней воздухом

Включаются
нагревательные элементы

Отверстия

в
роторе позволяют воздуху свободно
циркулировать

Отверстия
в роторе позволяют воздуху свободно
циркулировать

Нагревательные
элементы выключаются

Вентилятор
направляет воздух по всей камере

Вентилятор
направляет воздух по всей камере

Воздушный
клапан открывается, выпуская горячий
воздух

Вентилятор
направляет воздух в камеру

Холодный
воздух подается внутрь

После
завершения выполнения заданной программы
термоциклирования прибор выполнит
охлаждение образцов и камеры до безопасной
(комнатной) температуры.

2.3. Оптическая система мультиканальной
детекции

Оптическая
система мультиканальной детекции
Rotor-Gene
6000
включает
до 6
каналов
для детекции излучения различных
флуорофоров, предоставляя широкие
возможности для проведения мультиплексных
реакций. Постоянная длина оптического
пути при детекции всех образцов
обеспечивает максимальную воспроизводимость
и точность детекции флуоресцентного
сигнала каждого из образцов. Оптическая
система Rotor-Gene
6000 не требует ни проведения калибровки,
ни компенсации искажений при измерении,
используемых в других системах.

Когда
пробирки с образцами в ходе вращения
проходят перед модулем детекции светодиод
с высокой энергией снизу освещает
образец для возбуждения флуоресценции
в реакционной смеси, и фотоэлектронный
умножитель, находящийся сбоку, детектирует
энергию флуоресцентного излучения,
проходящего через соответствующий
светофильтр. При этом излучение проходит
через тонкие стенки пробирки в нижней
ее части. Эти данные пересылаются на
персональный компьютер, который усредняет
сигнал для каждого образца, измеренный
за каждый из оборотов. Эти данные
выводятся на экран в режиме реального
времени в форме графика зависимости
флуоресценции от номера цикла ПЦР или
от температуры. Постоянная длина
оптического пути в ходе измерения для
каждого из анализируемых образцов
обеспечивает максимальную точность и
воспроизводимость измерения независимо
от положения образца в роторе. При этом
совершенно не нужно использовать
пассивный краситель (флуорофор) для
нормализации данных.

Рисунок.
Оптическая
система прибора Rotor—Gene
6000

Реакционная
камера

Детекционные
фильтры

Пробирки
в роторе вращаются, проходя между
источником света и детектором

Источники
света — светодиоды

Узел
вал/двигатель

В
приведенной ниже таблице представлены
характеристики 6 каналов, которые можно
использовать для проведения мультиплексного
анализа, и специального канала для
проведения анализа с плавлением высокого
разрешения (High
Resolution
Melt).
Для каждого канала указаны флуоресцентные
красители, которые можно детектировать
с его помощью.

КАНАЛ	Длины волн света возбуждение/детекция	Примеры детектируемых флуорофоров
Blue (синий)	365 nm / 460 nm	Biosearch Blue™, Marina Blue®, Bothell Blue®, Alexa Fluor® 350
Green (зеленый)	470 nm / 510 nm	FAM™, SYBR®Green1, Fluorescein, EvaGreen™, Alexa Fluor® 488, Pico® Green
Yellow (желтый)	530 nm / 555 nm	JOE™, VIC™, HEX™, TET™, CAL Fluor® Orange 560, Yakima Yellow®, Alexa Fluor®532
Orange (оранжевый)	585 nm / 610 nm	ROX™, Cy3.5™, Redmond Red®, Alexa Fluor® 568, Texas Red®.
Red (красный)	625 nm / 660 nm	Cy5™, Quasar® 670, LC Red 640®, CAL Fluor® Red 590
Crimson (темно-красный)	680 nm / 712 hp	Quasar® 705, LC Red 705®, Alexa Fluor® 680
High Resolution Melt (плавление с высоким разрешением)	460 nm / 510 nm	LC Green® Plus

Для
проведения мультиплексного анализа
наиболее рекомендуется использовать
набор флуорофоров FAM,
JOE,
ROX
и Cy5,
поскольку при их использовании
перекрестные помехи после оптимизации
не превышают 1%.

В
качестве гасителей для вышеуказанных
флуорофоров можно использовать следующие:
BHQ-1
(480-580нм), BHQ-2
(550-650нм), BHQ-3
(620-730нм), а также TAMRA
для FAM
или JOE
(VIC).

Для
проведения анализа в формате «FRET-зондов»
рекомендуются следующие установки
каналов. Для детекции в формате
«FRET-гашения»
используется канал, соответствующий
флуорофору, например, для пары FAM-BHQ1
используется зеленый канал Green,
а для пары JOE-BHQ1
– желтый канал Yelloy.
Для детекции обычных «FRET-зондов»
используются каналы приведенные в
таблице:

FAM-Cy5, FAM-LC Red 640	470nm/ 660nm	JOE-LC Red 705	530nm / 712nm long pass
JOE-Cy5, JOE-LC Red 640	530nm / 660nm	FAM-LC Red 705	470nm / 712nm long pass

2.4 Типы роторов

В
системе Rotor—Gene
6000
доступны для использования 3 типа
роторов, каждому из которых соответствует
свой тип используемых с ним пробирок.

2.4.1
Ротор
36-луночный

Этот
ротор со своим фиксирующим кольцом
предназначен для работы со стандартными
пробирками объемом 0,2 мл, которые
используются в большинстве случаев.
Используют обычные пробирки с плоской
крышкой. Допускается также использовать
пробирки с выпуклой крышкой. Поскольку
детекция в системе Rotor—Gene
6000
проводится через стенки пробирки в ее
нижней части, не требуется использовать
специальные пробирки с оптически
прозрачной крышкой.

Убедитесь,
что пробирки хорошо закрыты, плотно
надавливая на крышки пробирок.
Во избежание открывания пробирок при
работе с Rotor-Gene
используется фиксирующее кольцо.

2.4.2.
72-луночный
ротор

72-луночный
ротор и его фиксирующее кольцо
предназначены для работы со специальными
пробирками объемом 0,1 мл, стрипованными
по 4 штуки. Эти пробирки и крышки к ним
выпускает компания «Corbett
Research».

Использование этих пробирок позволяет
уменьшить объем реакционной смеси до
5 мкл.
Крышки обеспечивают безопасное и
надежное закрывание пробирок.

2.4.3.
Ротор
для Gene
Disc
72-луночный или 100-луночный

Ротор
для Gene Disc 72-луночный
и
его фиксирующее кольцо позволяют
использовать Gene
Disc
72,
содержащий 72 пробирки объединенные в
одну структуру, для высокопроизводительного
формата анализа. Для закрывания пробирок
в Gene
Disc
используются не крышки, а наклеиваемая
при нагревании прозрачная полимерная
пленка. Преимущество пленки состоит в
том, что она предотвращает контаминацию,
обеспечивая прочное длительное
заклеивание. Для дополнительной
информации о Gene
Disc см
соответствующий раздел.

Помимо
Gene
Disc
72 можно использовать Gene
Disc
100, содержащий 100 аналогичных пробирок
объединенных в одну структуру с
соответствующим ему ротором.

Таблица.
Спецификация
роторов

Тип ротора	Число образцов	Тип пробирок	Диапазон объемов реакционной смеси
36-луночный	36	0.2 мл пробирки для ПЦР	15 – 50 мкл
72-луночный	72	0.1 мл стрипованные пробирки и их крышки	5 – 30 мкл
Gene—Disc 72	72	0.1 мл Gene-Disc 72	10 – 25 мкл
Gene—Disc 100	100	0.03мл Gene-Disc 100	10 — 30 мкл

ВНИМАНИЕ:
Роторы, предназначенные для прибора
Rotor—Gene
6000
не могут быть использованы с прежде
выпускаемыми моделями Rotor—Gene
3000.

Для
модели Rotor—Gene
3000
используйте, пожалуйста, роторы из его
комплектации.

1. Элементы
   прибора и комплектующие

3.1
Распаковка прибора Rotor—Gene

Когда
Вы получите прибор Rotor—Gene
6000,
он будет упакован в коробку, содержащую
все необходимое для установки и начала
работы с прибором. Далее приведен список
аксессуаров, поставляемых с прибором.
Используйте этот список, чтобы убедится,
что все элементы присутствуют.

Вы
заметите коробку с аксессуарами, которая
находится сверху защитного кожуха из
пены.

В
этой коробке содержится:

Инструкция
Инсталляционный CD
96-ти луночный алюминиевый штатив PN# 3001-009
72-ти луночный алюминиевый штатив PN# 3001-008
36-ти луночный ротор PN# 6001-003
Фиксирующее кольцо для 36-ти луночного ротора PN# 6001-004

С
двух сторон защитного кожуха из пены
Вы найдете следующее:

Gene—Disc герметизирующая пленка (60 шт в коробке) PN# 3001-023
Gene—Disc установка для термозапаивания PN# 3001-020
Держатель ротора PN# 3001-36

3.3
Важно:
прочтите перед запуском Rotor—Gene

Перед
запуском Rotor—Gene
6000
обратите внимание на следующее:

ВНИМАНИЕ:
НЕ
ПЫТАЙТЕСЬ открыть крышку прибора во
время работы (термоциклирования), когда
ротор прибора вращается. Если Вы все же
сможете открыть крышку и получить доступ
к внутренним частям, Вы рискуете
соприкоснуться с нагревательным
элементом, электропроводящими и быстро
движущимися частями прибора. Это опасно
для Вас и выведет из строя прибор.

ВНИМАНИЕ:
Если
Вы экстренно прерываете работу прибора
по выполнению
ПЦР-анализа, выключив
прибор, откройте крышку и дайте камере
остыть, иначе Вы рискуете обжечься о
горячие части прибора.

ВНИМАНИЕ:
Если
прибор используется особым образом, не
указанным производителем, можно повредить
защиту, обеспеченную прибором.

ВНИМАНИЕ:
Рекомендуется, чтобы нижняя часть
прибора находилась на свободной чистой
поверхности, так как такой мусор как
бумага может закрыть вентиляционные
отверстия и нарушить охлаждение
Rotor—Gene
6000.

Предостережение:
Всегда используйте фиксирующее кольцо
для ротора. Это предотвратит возможность
открывания пробирок во время эксперимента.
Иначе, если пробирки откроются или
выпадут из лунки ротора, они могут
нанести повреждения в реакционной
камере.

Если
Вы коснетесь Rotor-Gene
6000
во время циклирования, то, поскольку Вы
заряжены статическим электричеством,
в некоторых случаях Rotor-Gene
6000 может
при этом повторно включиться. Однако
программное обеспечение повторно
запустит Rotor-Gene
6000
и
продолжит выполнение программы анализа.

Убедитесь,
что программное обеспечение не работает
в виртуальном режиме. Нажмите меню Файл
и выберите Настройка…
Убедитесь, что не стоит галочка, отмечающая
опцию виртуальный режим.

Если
Настройка… не доступна,
это значит, что данная функция была
выполнена дистрибьютором, выполнявшим
установку и настройку оборудования.

3.3.1
Предупреждающие знаки

ВНИМАНИЕ:
Прибор
имеет наклейку, в которой указаны
напряжение и частота питающей сети и
предохранителя. Прибор должен
использоваться при этих условиях. На
приборе есть два дополнительных значка
(черные символы на желтом фоне).

Первый
предупреждающий символ
— общий символ опасности, расположенный
рядом с переключателем напряжения.
Перед первым использованием Rotor—Gene
6000 удостоверьтесь,
что переключатель установлен в правильное
положение (220V
— См. параметры прибора).

Внимание:
Если
Вы меняете положение переключателя
напряжения в то время как прибор включен
в сеть, это может привести к серьезной
поломке прибора Rotor—Gene
6000.

Не
включайте Rotor—Gene
6000
в сеть, если вы переключаете вольтаж.
См. раздел «Установка прибора».

Второй
предупреждающий знак
– знак горячей поверхности, расположенный
рядом

с
реакционной камерой; его видно при
открытой крышке.

4. Установка
и обслуживание.

Установка
Rotor-Gene
6000
выполняется
просто и занимает совсем немного времени.

Не
требуется проводить процедуры калибровки
прибора для его установки.

4.1 Установка прибора

Установите
Rotor—Gene
6000 на
относительно ровную поверхность.

Убедитесь,
что достаточно свободного места сзади
прибора для того, чтобы полностью открыть
его крышку, и что Вы без затруднений
можете достать до выключателя питания
на задней стенке. Должен также быть
доступ для выключения шнура питания из
розетки при необходимости.

Прежде
чем включить Rotor—Gene
6000 проверьте
переключатель напряжения на задней
панели прибора. Он устанавливается при
производстве. Убедитесь, что его установка
соответствует напряжению в вашей сети
– 220 V.
Если установка переключателя не
соответствует используемому напряжению,
обратитесь к специалисту службы
технической поддержки.

ВНИМАНИЕ:
Переключение
установки выбора напряжения при
подключенном к сети приборе может
привести к серьезному повреждению
прибора.

Таблица.
Спецификации
прибора

Размеры	ширина 370 мм (14.6«), глубина 420 мм (16.5«), глубина с открытой крышкой 560 мм (22«), высота 275 (10.8«)
Масса	14 кг
Электрические параметры	200 – 240 В (50 Гц), 100 – 200 B (60 Гц) потребляемая мощность 560 Вт (при работе), 8 Вт (в режиме ожидания)
Допустимые температуры транспортировки	От -25°С до 70°С
Диапазон температуры при работе	От 15°С до 35°С

Присоедините
прилагаемый USB-кабель
или RS-232
кабель к USB
порту или COM-порту
на задней панели компьютера. Подключите
USB-кабель
или RS-232
кабель к Rotor—Gene
6000 сзади.
После этого подключите Rotor—Gene
6000
к
источнику питания.

Подписи
на рисунке (слева направо): Переключатель
Вкл/Выкл (сверху), Разъем кабеля питания,
Переключатель Напряжения, Серийный
Номер, Последовательный (COM)
порт, USB-порт.

4.2 Обслуживание системы

Единственное,
что требуется выполнять пользователю,
это поддерживать линзы в относительной
чистоте и освобождать их от пыли, которая
может накапливаться со временем.

Рекомендуется
держать крышку прибора закрытой, если
он не используется, чтобы минимизировать
попадание пыли в камеру.

Заглядывая
в термоциклирующую камеру можно заметить
в дне камеры округлую линзу, за которой
располагаются светоизлучающие светодиоды.
Если эта линза покрывается пылью или
другими загрязнениями, следует очистить
ее, используя хлопковый тампон и этиловый
спирт.

На
боковой стенке нагревательной камеры
также имеется круглая линза. На ней
обычно не накапливается пыль, однако,
если помещать в камеру влажные или
пыльные пробирки, то частицы с них могут
попадать при вращении ротора на линзу.
Если требуется очистить эту линзу, ротор
можно снять, открутив фиксатор в центре.
Линзы можно чистить, используя хлопковый
тампон и этиловый спирт.

4.3 Установка
программного обеспечения

4.3.1
Установка программного обеспечения

Чтобы
установить программное обеспечение
вставьте компакт-диск с программой
Rotor—Gene
6000
в
дисковод Вашего компьютера. На диске
Вы увидите список опций для пользователя.
Выберите опцию установки программы
Install
Rotor—Gene
Software.

Следуйте
всем появляющимся инструкциям по
установке.

На
рабочем столе появится значок программы
Rotor—Gene
6000 Series
Software 1.7

Таблица.
Требования
к компьютеру

Операционная система	Microsoft Windows XP
Процессор	Pentium IV или выше, 2 ГГц
Основная память	512 MB RAM
Емкость жесткого диска	10 GB HDD

После того, как
программное обеспечение установлено
на компьютер, присоединенный

к
Rotor-Gene
6000,
включите прибор переключателем включения,
находящимся справа на задней стенке
корпуса прибора. Появится голубая
подсветка светового индикатора Ready,
что означает, что прибор готов к работе.

Дважды
щелкните по значку программы Rotor—Gene
6000 Series
Software 1.7 на
рабочем столе, чтобы запустить работу
программы, появится экран приветствия
Welcome.
Это
окно появляется только один раз после
установки программы. Нужно внести в
соответствующие поля информацию о
серийном номере прибора и о том, через
какой порт он подключен к компьютеру.

Machine
Serial
Number
(Серийный номер): впечатайте
серийный номер прибора (шесть цифр),
указанный на задней панели его корпуса.

Offset
Coefficient:
впечатайте
значение параметра Offset
coefficient,
указанное там же сразу после номера
прибора, если цифра там не указана, то
введите значение 0.

Port
(Порт): Выберите,
какой порт используется: USB
или последовательный COM,
если
Вы не знаете, какой COM-порт
используется, выберите авто-детекцию
Auto—Detect.

Exit
Program:
Выход
из программы.

Run
in Virtual Mode
(Виртуальный
режим).
Если
Вы хотите инсталлировать демонстрационную
версию программного обеспечения на
компьютер, к которому не подключен
прибор Rotor-Gene, оставьте эту опцию
помеченной при запуске. Программа будет
полностью функционально активна и может
даже показывать в виртуальном режиме
эмулированный анализ в режиме реального
времени.

Но
чтобы выполнять реальные анализы на
приборе, в программе, установленной на
его компьютер, не нужно отмечать опцию
Run
in
Virtual
Mode,
иначе Вам потребуется изменить эту
установку в меню Setup.

После
установки всех параметров нажмите
кнопку Begin.
Подождите, пока пройдет инициализация,
что может занять несколько секунд.
Если бокс в строке Run
in
Virtual
Mode
не
отмечен, то прибор инициализируется и
автоматически откроется программа
Rotor—Gene.

Если
был выбран виртуальный режим, то на
экране появится сообщение:

4.3.2
Версия программного обеспечения

Усовершенствование
программного обеспечения для Rotor-Gene
происходит постоянно. Чтобы узнать
номер Вашей версии, щелкните Help
(Помощь),
а затем About
Rotor-Gene (Про Rotor-Gene).

Появившаяся
картинка на экране представляет общие
сведения о программном обеспечении и
включает номер версии программного
обеспечения, серийный номер термоциклера,
а также дату последнего обновления
программы.

4.3.3
Обновление программного обеспечения

Обновление
программы пользователь может получить
на веб-сайте компании Corbett
Life Science
: http://www.corbettlifescience.com.
Этот адрес можно взять из меню Help
программы Rotor-Gene.
Обновление программы пользователь
получает бесплатно. Нужно зарегистрироваться
на сайте, чтобы получить логин и пароль.

4.3.4
Что нового в программе

Здесь
описываются новые опции версии 1.7
программы Rotor-Gene 6000 и приводятся ответы
на обычно задаваемые вопросы о ранее
имевшихся опциях, которые были изменены
или перемещены. Эти изменения в программе
включают и изменения, запрошенные
пользователями.

Кривые
плавления с высоким разрешением – HRM
(High
Resolution
Melts)

Этот
анализ позволяет характеризовать
образцы ДНК-мишени по длине, GC-составу
и более детально характеризовать
последовательность ДНК-мишени по ее
комплементарности зонду. Генотипирование
по полиморфизму единичных нуклеотидов
(SNP)
– типичное применение данного анализа,
при этом его использование позволяет
снизить себестоимость тестирования по
сравнению с другими применяемыми для
этого методами.

Export
to LinReg

Теперь
стало возможно экспортировать данные
напрямую в LinReg. Поскольку LinReg использует
данные, нормализованные после
количественного анализа, Вам нужно
сделать количественный анализ до
экспорта.

Новая
функция: Шаблоны анализа

Добавлена
возможность для импорта и экспорта
специфических установок анализа, которые
показываются в главном окне анализа.
Такие специфические установки анализа
как bin и определение генотипов сохраняются
в файле и могут быть загружены в другие
файлы анализа.

Небольшие
улучшения в интерфейсе программы

• В
окне выбора формата анализа данных
добавлена возможность показа дополнительных
типов анализов.

• Добавлены
дополнительные статистические функции
для сравнительного количественного
анализа «Сomparative Quantitation».

• Исправлено
изменение размеров окна выбора образцов.

• Расширено
окошко отчётов.

• Исправлены
границы страниц для отчетов результатов

• Улучшена
точность графика температуры во время
детекции.

Синхронизированы
имена образцов на страницах таблицы
образцов

Для
мультиплексных анализов, когда используют
множественные страницы в таблице
образцов, и на этих страницах используют
идентичные имена образцов, добавлена
опция автоматического обновления
(синхронизации) названий и цветовых
обозначений образцов.

Интеграция
TeeChart Office

Интеграция
с TeeChart Office была сделана так, что графики
могут быть выбраны для редактирования
в TeeChart
Office
напрямую из программы Rotor-Gene.
TeeChart Office можно бесплатно загружать с
нашего web-сайт. Этот программное
обеспечение даёт возможность изменять
стиль линии, добавлять легенду к

графикам
и изменять шрифт, как того требуют
некоторые публикации.

ID
формат для образцов

Теперь
возможно переключать формат нумерации
образцов в редакторе образцов.

Установка
шага температуры для опции “Touchdown”

Стало
возможным устанавливать значение для
шага снижения температуры с каждым
следующим повтором цикла от 0.1 до 2
градусов за один шаг

Регулируемые
Бины для кривой плавления (Melt Bins)

Введена
возможность назначать имена и диапазон
температуры, присвоенный для бина.
Параметры бина теперь можно редактировать.

Добавлена
возможность определения диапазона при
автоматической оптимизации параметра
усиления “gain”

Добавлена
возможность определения диапазона
значений параметра “gain”,

сканируемых во время автоматической
оптимизации.

Автоматическая
оптимизация параметра усиления «gain»
добавлена в шаблон «SYBR
Green»

В
шаблоне «SYBR Green» предусмотрено проведение
автоматической оптимизации параметра
«gain»
по образцу в первой позиции.
Эта процедура может быть задана c
использованием мастера Быстрого Старта.

Добавлен
шаблон «New
Empty
Run»
(«Новый Пустой Шаблон Анализа»)

Был
добавлен новый шаблон который можно
использовать в Мастере. Этот шаблон не
базируется ни на какой специальной
химической реакции. Он позволяет задать
программу анализа для такого формата
реакции который не поддерживается
мастером в настоящее время. С помощью
этого шаблона можно ввести программу
для любого вида анализа.

Улучшение
Мастера Быстрого Старта

Добавлена
кнопка для сохранения заданных установок
в виде нового шаблона.

Добавлена
возможность открывать шаблон из другой
директории.

5. Подготовка
к проведению анализа

Программное
обеспечение Rotor-Gene
6000
позволяет легко и удобно проводить Ваши
анализы.

5.1 Подготовка
пробирок с реакционной смесью

Как
было описано в разделе Типы
роторов (2.4),
в
системе Rotor—Gene
6000
доступны для использования 3 типа
роторов, каждому из которых соответствует
свой тип используемых с ним пробирок.
Можно использовать 36-луночный ротор
для пробирок объемом 0.2 мл, 72-луночный
ротор для пробирок объемом 0.1 мл,
стрипованных по 4, или Gene
Disc
со специальными пробирками объединенными
в один модуль, которые запечатываются
полимерной пленкой.

Подготовку
пробирок с реакционной смесью можно
проводить, используя специальные
штативы: 96-луночный штатив для пробирок
объемом 0.2 мл, 72-луночный штатив для
пробирок объемом 0.1 мл, или штатив для
Gene
Disc.
Все штативы сделаны из алюминия и могут
быть предварительно охлаждены.

В
72-луночный штативе есть также лунки,
позволяющие разместить до 8 пробирок
объемом 0.5 мл, которые можно использовать
для приготовления мастер-микс, а также
16 пробирок объемом 0.2 мл.

Поставьте
пробирки в лунки штатива и внесите
нужные компоненты реакционной смеси.

Плотно
закройте крышки пробирок и визуально
проверьте, что все они хорошо закрыты.

Вставьте
пробирки в соответствующий им ротор и
убедитесь, что все пробирки находятся
в правильном положении в роторе. Если
пробирки не до конца входят в ячейки
ротора, они будут плохо детектироваться,
это приводит к снижению сигнала и
чувствительности анализа. Можно
воспользоваться специальной подставкой
для ротора, чтобы было удобно помещать
в него пробирки.

Инновационный
роторный дизайн прибора Rotor—Gene
6000
обеспечивает максималь-ную точность и
эквивалентность температурного режима
для всех пробирок в роторе.

Чтобы
достичь максимальной точности
температурного режима, заполните все
ячейки ротора пробирками, не используемые
для анализируемых образцов ячейки
заполните пустыми пробирками. Для этого
следует иметь некоторое количество
пустых пробирок.

Наденьте
соответствующее фиксирующее кольцо на
ротор, пропустив три пина фиксирующего
кольца во внутренние отверстия ротора.
Фиксирующее кольцо будет удерживать
пробирки в правильном положении во
время работы прибора.

Вставьте
ротор с реакционными пробирками в камеру
прибора Rotor—Gene
6000,
совместив отверстие для фиксации в
роторе с фиксирующим пином на штифте и
надавив слегка на ротор. Чтобы снять
ротор с оси слегка надавите на фиксатор
сверху, чтобы он освободил ротор, и
потяните ротор вверх.

После
того как ротор с фиксирующим кольцом
закреплены в камере, закройте крышку
прибора и запустите выполнение анализа
в программе Rotor—Gene.

1. Подготовка
   Gene—Disc

Gene-Disc
72 содержит 72 пробирки, объединенные в
одно целое, и может использоваться для
повышения пропускной способности
методики при достаточно большом
количестве анализируемых образцов. Для
него не используются крышки, а используется
специальная полимерная пленка для
термогерметизации. Ее накладывают
сверху и запечатывают (заклеивают) с
помощью нагревания. Преимущество пленки
– в том, что она обеспечивает прочное,
длительное запечатывание пробирок,
предотвращая возможность контаминации.

Используя
специальный штатив для Gene-Disc,
можно подготовить реакционные смеси
либо вручную, либо использую автоматическую
систему CAS
1200. Чтобы поместить Gene-Disc
на штатив используйте петлю в первой
позиции Gene-Disc.
Скользите Gene-Disc
по штативу и пробирки попадут в ячейки
штатива. Дизайн блока обеспечивает
удобное пипетирование.

Достаньте
один лист запечатывающей пленки и
снимите с нее центральную часть, слегка
изогнув пленку в середине, выпятив
центральную часть, и аккуратно оторвав
ее.

Надпись
SIDE
UP
(Верхняя сторона) обеспечивает правильную
ориентацию пленки для ее заклеивания.
Проверьте, что эта надпись читается
правильно внизу штатива, над рядом лунок
для реактивов. Отверстие в центре пленки
вместит выступающий цилиндр центральной
части штатива и пленка ляжет сверху на
Gene-Disc.

Включите
аппарат для теплового запечатывания
выключателем слева сзади. Загорится
красный индикатор Power
сверху
на аппарате. Необходимо дать аппарату
прогреться в течение примерно 10 минут
после включения, чтобы он достиг нужной
температуры, после чего загорится
зеленый индикатор
Ready.
После этого аппарат можно оставить
работающим постоянно, специальный
вентилятор воздуха при этом обеспечивает
безопасную при прикосновении температуру
поверхностей аппарата.

Поместите
внутрь Gene-Disc
с пленкой в штативе, используя направляющие
по бокам штатива. Убедитесь, что штатив
полностью помещен внутрь.

Высвободите
черный фиксатор на крышке аппарата,
чтобы опустить заклеивающий механизм.
Для этого надавите вниз синий анодированный
бар в верхней передней части ячейки
ладонью и надавите на черный фиксатор.

Когда
механизм опустится, появится оранжевый
индикатор Sealing
сверху.

После
того, как раздастся звуковой сигнал,
надавите на синий анодированный бар,
чтобы поднять и зафиксировать заклеивающий
механизм в исходном положении. Поднимайте
механизм сразу после звукового сигнала,
иначе при превышении времени Gene-Disc
может деформироваться

Вытащите
штатив из аппарата для запечатывания.
Дайте остыть пленке примерно 10 секунд,
затем оторвите лишнюю, выступающую за
края диска часть пленки. Выньте Gene-Disc
из штатива. Чтобы поместить Gene-Disc
в ротор используйте петлю в первой
позиции, чтобы найти нужную ориентацию.

5.3 Включение прибора Rotor-Gene

Rotor—Gene
запускается в результате следующей
последовательности операций:

1.
Включите персональный компьютер и
подождите, пока загрузится Windows
ХP.

2.
Включите Rotor-Gene,
нажав кнопку cправа
на задней панели прибора и дождитесь
загорания индикатора (светодиода)
напротив надписи Ready
на крышке прибора.

3.
Двойным щелчком по ярлыку Rotor-Gene
запустите программу.

Теперь
Rotor-Gene
готов к работе.

6. Запуск
анализа (Старт), установка параметров
программы теста

Установка
параметров и запуск выполнения анализа
на приборе RotorGene
может быть осуществлен либо при
использовании Мастера
Быстрого Старта
(Quick
Start)
или Детального
Мастера
Старта (Advanced).
Для удобства Мастер содержит ряд шаблонов
в которых установлены параметры
термоциклирования и детектирующие
каналы по умолчанию. Вам нужно выбрать
подходящий шаблон из списка. Для
переключения между видами Мастера
используйте кнопки вверху окна Новый
запуск (New
Run).

Как
предыдущий (Perform
Last
Run)
используются
все параметры (профиль термоциклирования,
обозначение образцов, детектирование)
установленные в последнем из ранее
проведенных анализов

Sybr
Green
(R)
I:
трехступенчатый
профиль термоциклирования с кривой
плавления и детекцией сигнала на Зеленом
(Green)
канале

Зонд
с двойной меткой (Dual
Labeled
Probe):
двухступенчатый
профиль термоциклирования

с
детекцией сигнала на всех

(на
любых) каналах

FRET
с гашением (Quenched
FRET):
трехступенчатый
профиль циклирования с кривой плавления
и детекцией сигнала на Зеленом и Желтом
каналах (Green
и Yellow)

Temperature
Calibration
Rotor
Run:
используется
с выпускаемым Corbett
Оптическим ротором для Верификации
Температуры (Corbett’s
Optical
Temperature
Verification)

Измерение
концентрации ДНК (DNA
Concentration
Measurement)
–
это шаблон по умолчанию, используемый
для измерения концентрации ДНК с
применением инеркали-рующего красителя

Rotor—Gene
Demo
Kit
содержит
профили, используемые для Sybr
Green
(R)
I
и Dual
Labeled
Probe
демонстрационных
наборов

Профили
циклирования и детектирования могут
быть изменены в этой опции за исключением
Temperature
Calibration
Rotor
Run
и
DNA
Concentration
Measurement

Любой
шаблон отредактированный пользователем
может быть добавлен в этот список при
его сохранении.

6.1
Мастер быстрого старта/ Quick
Start
Wizard

Выберите
вкладку Quick
Start (Быстрый
Старт)
в
окне
New
Run
и
выберите шаблон программы
анализа.
Выберите нужный шаблон для программы
анализа из предлагаемого списка Мастера
Quick
Start (Быстрый Старт)
в соответствии с их описанием в предыдущем
разделе.

6.1.1 Выбор
ротора/ Rotor
Selection

В
окне Rotor
Type
(Тип Ротора) выберите
нужный тип ротора.

Фиксирующее
пробирки кольцо должно быть прикреплено
к ротору. Кликните опцию Locking
Ring
Attached
(прикрепление фиксирующего кольца),
пометив ее галочкой, и далее следуйте
указаниям появляющимся на экране.

6.1.2
Подтверждение Температурного профиля
(Confirm
Profile)

Выбранный
Вами шаблон импортирует параметры
термоциклирования и назначенные для
детекции каналы. Изменить эти параметры
при необходимости можно, используя
Редактор Профиля в Окне Confirm
Profile.
Подробно редактирование профиля
термоциклирования и детекции
флуоресцентного сигнала описано в
разделе 6.3
Редактирование профиля / Edit
Profile.

В
этом окне с помощью кнопки Start
Run
осуществляется
запуск выполнения программы анализа
прибором.

6.1.3 Сохранение
данных анализа ( Save
Run
)

Файл
с данными анализа может быть сохранен
по желанию пользователя в любом выбранном
месте. Кликнув Save
Run,
Вы открываете окно Save
As
и сохраняете данные. Вы можете использовать
название которое предлагает программа
– с определением даты, используемого
шаблона и порядковый номер исследования,
проводимого в этот день по данному
шаблону. Например, как показано на
рисунке, анализ, проводимый первый раз
11 Мая 2004 по выбранному шаблону Sybr
Green(
R
) I
будет сохранен в файле под указанным
названием:

6.1.4
Таблица
образцов
(Edit Samples)

После
того как прибор начнет выполнение теста,
согласно заданной программе, автоматически
откроется окно редактирования таблицы
образцов. Введите обозначения
(идентификаторы) образцов и другую
нужную информацию о них в соответствующие
графы таблицы. Подробнее редактирование
таблицы образцов описано в разделе 6.5
Редактирование
таблицы образцов.

1. Детальный
   Мастер Старта / Advanced
   Wizard
   
   Мастер Детальной установки параметров

Выберите
вкладку Advanсed
в окне New
Run
и
выберите шаблон запуска
анализа.
«Детальный» вариант мастера
Advanсed
содержит опции которых нет в Мастере
Быстрого старта (Quick
Start),
а именно, такие опции как оптимизация
параметра усиления сигнала (gain
auto-optimisation)
и выбор скорости ротора (Rotor
speed).
Мастер Advanced
wizard
последовательно
открывает окна, в которых Вы можете
задать (отредактировать) необходимые
параметры программы анализа. Для перехода
к следующему окну мастера используйте
кнопку Next
>> в
нижней части каждого окна. Чтобы вернуться
к предыдущему окну используйте кнопку
<<Back.

6.2.1
Первое окно – выбор ротора / Welcome
Screen

Открывшийся
экран запрашивает информацию о типе
используемого ротора. Так же, как и в
Мастере Quick
Start,
Вы должны пометить, что фиксирующее
кольцо прикреплено к ротору, поставив
галочку в строке Locking
Ring
Attached.
Чтобы продолжить, нажмите кнопку
Next
>>
внизу окна.

Картинка с сайта: textarchive.ru

6.2.2.
Второе окно

В
данном окне вы можете обозначить имя
пользователя и информацию о выполняемом
анализе. Необходимо ввести объем
реакционной смеси. Rotor-Gene
настроен на объем образцов 20-25 мкл. При
использовании больших объемов программное
обеспечение рекомендует увеличить
длительность «полок» при циклировании.

При
использовании 72-луночного ротора нужно
определить, какой из трех возможных
форматов расположения и нумерации
образцов Вы используете, в строке Sample
Layout.
По умолчанию предлагается вариант
нумерации пробирок цифрами 1,
2, 3…
(от 1 до 72). Если есть соответствие образцов
в стрипах друг другу (по положению в
стрипе при использовании 72-луночного
штатива), можно использовать формат
нумерации 1A,
1B,
1C…
Если последовательные (соответствующие
друг другу) образцы находятся в каждой
восьмой пробирке (при использовании
многоканальной пипетки), можно использовать
формат A1,
A2,
A3…
Для
большинства пользователей достаточно
использовать вариант, предложенный по
умолчанию.

6.2.3
Третье окно (окно профиля термоциклирования
и оптимизации параметра усиления сигнала
«gain»)

Этот
экран позволяет вносить изменения в
температурный профиль Temperature
Profile
и
установки детектируемых каналов Channal
Setup.
Кликнув
кнопку
Edit
Profile… (редактирование
профиля) в верхней половине окна, Вы
открываете редактор профиля, позволяющий
изменить условия термоциклирования и
выбрать детектирующие каналы. Подробно
редактирование профиля термоциклирования
и детекции флуоресцентного сигнала
описано в разделе 6.3
Редактирование профиля / Edit
Profile.

Профиль
отображается графически в окне Edit
Profile.
Список блоков, из которых состоит профиль
представлен ниже графической схемы.
Профиль может состоять из следующих
блоков: Hold
(удерживание фиксированной температуры),
Cycling
(циклическое повторение нескольких
шагов с разными температурами), Melt
(измерение
кривой плавления), а также HRM
(плавление
с высоким разрешением; доступно, если
данный прибор имеет соответствующий
специальный канал HRM).
Установки температуры и времени для
каждого блока профиля можно редактировать,
кликнув по соответствующему сегменту
на графической схеме или по его обозначению
в списке. Также можно изменять назначение
детекции флуоресцентного сигнала по
нужным каналам. Сделав нужные изменения,
нажмите кнопку OK.

После
установки температурного профиля
кликните кнопку Gain
Optimisation
в
нижней половине окна
в
результате чего откроется
окно параметров автоматической калибровки
по параметру усиления сигнала «gain»
Auto
Gain
Optimisation
Setup.
Эта процедура предназначена для
автоматической оптимизации параметров
детекции флуоресцентного сигнала, с
тем, чтобы сигналы от тестируемых
образцов находились в нужном диапазоне
(не выходили за пределы), она особенно
важна, когда Вы в первый раз проводите
данный тест. Подробнее см. в разделе 6.4
Автоматическая Оптимизация параметра
усиления Gain.

6.2.4
Четвертое окно

Нажав
кнопку Next
>>, Вы
откроете
последнее перед стартом окно, в котором
перечислены основные параметры программы
анализа. В этом окне (справа внизу)
находится кнопка Start
Run,
нажав которую Вы запускаете выполнение
программы анализа прибором. При этом
откроется окно Save
as,
в котором Вы вводите имя файла, в котором
сохраняются все данные этого анализа,
после чего начинается его выполнение.
До этого момента необходимо закрепить
ротор с образцами с фиксирующим кольцом
на оси и закрыть крышку прибора.

Картинка с сайта: textarchive.ru

После
начала выполнения анализа откроется
пятое окно – окно редактирования таблицы
образцов.
Подробно редактирование таблицы образцов
описано в разделе 6.5.

6.3 Редактирование
профиля / Edit
Profile

Кликнув
кнопку
Edit
Profile…
(редактирование
профиля) в верхней половине окна,

Вы
открываете редактор профилей, позволяющий
изменить условия термоциклирования и
выбрать детектирующие каналы.

Профиль
отображается графически в окне Edit
Profile.
Список блоков, из которых состоит профиль
представлен ниже графической схемы.

Профиль
может состоять из следующих блоков:
Hold
(удерживание фиксированной температуры),
Cycling
(циклическое повторение нескольких
шагов с разными температу-рами), Melt
(измерение
кривой плавления), а также HRM
(плавление
с высоким разрешением; доступно, если
данный прибор имеет соответствующий
специальный канал HRM).
Установки температуры и времени для
каждого блока профиля можно редактировать,
кликнув по соответствующему сегменту
на графической схеме или по его обозначению
в списке.

Добавить
новый блок в программу или удалить
ненужный блок можно с помощью следующих
кнопок, расположенных справа от окна
описания профиля:

Insert
after…
(Вставить
после): позволяет вставить блок
непосредственно после выделенного.

Insert
befor…(Вставить
до): позволяет вставить блок непосредственно
перед выделенным.

Remove…(Удалить):
удаляет
выбранный блок из профиля

Cycling
(блок Циклирования)

Этот
блок предназначен
для циклического повторения комбинации
заданных пользователем шагов с различной
температурой/временем, и проведения
измерений в заданных точках. Цикл
повторяется заданное количество раз.
Число повторов задается в строке This
cycle repeats X
times
(Этот
цикл
повторить X
раз) над
окном с графи-ческим отображением
данного блока циклирования.

Блок
циклирования, который выделен, отображается
графической схемой в нижней половине
окна. В цикле может быть несколько Steps
(Шагов),
для которых задается своя температура
и время удержания. Параметры каждого
шага (температуру, время, детекцию
флуоресцентного сигнала) можно изменять,
выделив его на графической схеме.

Чтобы
изменить параметры (температуру или
время) шага, щелкните по нему в окне
графической схемы цикла, чтобы данный
шаг был выделен темным фоном. После
этого можно изменять параметры температуры
и времени, кликнув по соответствующей
кнопке слева от графической схемы и
вводя нужные значения в ячейку, а также
задавать детекцию флуоресцентного
сигнала на данном шаге, щелкнув по кнопке
Not
Acquiring (Не детектировать).
Вы можете также менять температуру
шага, перетаскивая обозначающую ее
линию вверх-вниз, и аналогично менять
время удержания на заданной температуре,
перетаскивая графические линии
влево-вправо.

Добавить
шаг или удалить шаг из цикла можно с
помощью кнопок [+]
и [-]
в
правом верхнем углу окна с графической
схемой цикла.

Кроме
того, возможно постепенное снижение
температуры или удлинение времени
определённого шага цикла при повторении
их (указываются, если это желательно).

Touchdоwn
(Снижение
температуры): с помощью этой опции можно
задать постепенное снижение температуры
данного шага на определенную величину
(от 0.1 до 2°С) при каждом следующем повторе
цикла в течение нескольких первых шагов
(нужное число шагов задается). Это
отражается на графической схеме. Обычно
эта опция используется для шага отжига.

Long
Range
(Удлинение):
с помощью этой опции можно задать
постепенное увеличение длительности
выбранного шага на 1 секунду при каждом
следующем повторе цикла

в
течение нескольких первых шагов (нужное
число задается). Обычно опцию используют
для увеличения длительности шага
элонгации цепи.

Acquisition
(Детекция)

Можно
назначить детекцию флуоресцентного
сигнала по любому каналу на любом шаге
(шагах) блока циклирования. Для этого
используется кнопка Not
Acquiring
/ Acquiring
to….

Щелкнув
по кнопке Not
Acquiring
(или
по кнопке Acquiring
to…,
если для данного шага уже была ранее
назначена детекция), Вы откроете окно
Acquisition
– окно каналов детекции. В левой части
окна представлен список всех каналов,
которые можно использовать для детекции
(Available
Channells).
Справа – список назначенных для детекции
каналов (Acquiring
Channells).
Чтобы назначить детекцию по каналу,
переместите его название из левого
списка в правый список Acquiring
Channells
с
помощью кнопки стрелки

(между списками). Чтобы отменить детекцию
по каналу, соответственно, из правого
списка переместите его в левый с помощью
кнопки
.
Чтобы отменить детекцию по всем каналам
на данном шаге (очистить список) нажмите
кнопку

или кнопку Don`t
Acquire.

Таблица
Dye
Channel
Selection
Chart
(Таблица выбора каналов для флуорофоров)
в этом окне помогает пользователю
правильно выбрать канал, который нужно
использовать для детекции сигнала
определенного флуорофора. В этой таблице
представлены флуорофоры, широко
применяемые пользователями, но этот
список отнюдь не исчерпывает все
флуорофоры, которые можно детектировать
при использовании Rotor-Gene.

Если
для детекции назначены более одного
блока циклирования, то данные, полученные
в последующем блоке, могут быть соединены
с данными, полученными в предыдущем
блоке циклирования. Для этого можно
воспользоваться опцией Same
as
Previous
(вверху окна) с ниспадающим списком
других блоков циклирования в профиле.

Описанные
здесь опции для детекции применяются
аналогичным образом и для блока Melt
(Плавление),
за исключением возможности объединять
два графика вместе.

Hold
(Удерживание температуры)

Этот
цикл дает команду прибору Rotor-Gene
оставаться при определенной температуре
в течение заданного времени. Выведя
значения на экран щелчком этой кнопки,
параметры в соответствующих ячейках
можно изменить. Появится отдельный
экран, в котором вы можете ввести
значение в текстовую ячейку или установить
его скользящим бегунком.

При
использовании опции Оптической
денатурации, можно выбрать, какой блок
Hold
используется для калибровки. По умолчанию
для этого назначен первый Hold
в профиле, но это можно изменить, если,
например, используется сначала Hold
на 60°С,
а затем Hold
на 95°С.
Подробнее об опции оптической денатурации
см. в разделе Оптическая
Денатурация при циклировании.

Melt
/ Hybridisation
(Плавление / Гибридизация)

Для
цикла плавления определите начальную
температуру, окончательную температуру,
время ожидания до первой точки измерения,
время удерживания в каждой точке, и с
каким Приращением
Rising by,
т.е. на сколько градусов (от 0.1°С до 1°С)
будет произведен постепенный переход
между двумя температурами. Опция
Acquiring
To
(Детектировать
по),
установленная здесь для Melt
А,
может быть изменена после щелчка по
этой кнопке. Появится тот же экран, что
и при установке параметров детекции
для блока циклирования (Cycling),
где можно выбрать канал для детекции
флуоресценции.

Если
стартовая температура выше, чем конечная,
т.е. проводится снижение температуры с
детекцией, то название этого блока в
профиле автоматически изменится на
Hybridisation.

Стандартно
при измерении кривой плавления
используется повышение температуры
приростами в 1º и с удерживанием на
каждом шаге по 5 сек. С помощью Rotor—Gene
6000
можно проводить плавление с минимальным
шагом температуры 0.02. При этом минимальное
необходимое время удерживания на каждой
температуре зависит от того, какой шаг
увеличения температуры используется.

High
Resolution
Melts
(Плавление с высоким разрешением)

Плавление
с высоким разрешением процедура в
принципе аналогичная процедуре Melt
(Плавление),
и аналогичным образом редактируется
температурный профиль для нее. Отличие
процедуры Плавление
с высоким разрешением состоит
в том, что для детекции используется
только специальный канал HRM.
Именно за счет использования этого
специального канала получается снизить
количество шумов и значительно увеличить
разрешение получаемой кривой плавления.

Далее,
для блока HRM
можно
проводить процедуру оптимизации
параметра «gain»
непосредственно перед началом выполнения
блока HRM.
Параметр
«gain»
при этом оптимизируется так, чтобы
получать максимальные возможные значения
флуоресцентного сигнала от данных
пробирок, не достигая при этом насыщения
100 Fl
(т.е. не превышая верхнего предела шкалы).
Этим обеспечивается наилучший режим
для получения наиболее точной кривой
плавления на всех ее участках. Эта опция
включена по умолчанию, пользователю
нужно только выбрать, по какой из пробирок
будет проводиться оптимизация.

Процедура
HRM
позволяет
затем использовать дополнительные
опции при анализе данных, используя в
меню анализа раздел High
Resolution
Melt
Analysis
(Анализ кривых плавления с высоким
разрешением).
Эти
возможности доступны только тем
пользова-телям, которые работают с
прибором, поддерживающим HRM.

Оптическая
денатурация при циклировании (Optical
Denature
Cycling)

Оптическая
денатурация при циклировании
– принципиально новая функция, имеющаяся
только у приборов Rotor—Gene,
которая позволяет проводить анализ
плавления референс-образца в режиме
реального времени и в соответствии с
этим выбирать динамически температуру
денатурации в ходе циклирования. Данная
функция предназначена, чтобы оптимизировать
условия денатурации для данного типа
реакции и снизить время, требуемое для
проведения анализа.

Для
проведения этой процедуры просто
поместите пробирку с заранее
амплифицированным продуктом данной
реакции в позицию 1
в роторе.

В
этой пробирке также должен содержаться
реагент, используемые для детекции
денатурации ДНК.
Мы предлагаем использовать для этой
процедуры краситель SybrGreen
I.

При
первом нагревании до температуры
денатурации для этой пробирки измеряется
кривая плавления в диапазоне от 80
до 95ºС
(можно изменять этот диапазон).
Определяется Пик Кривой Плавления Melt
Peak
и соответствующий ему пороговый уровень
флуоресценции референс-образца Порог
Денатурации Denaure
Threshold.
Затем на шаге оптической денатурации
каждый раз измеряется флуоресценция
референс-пробирки и как только она
снижается ниже указанного порогового
уровня, прибор начинает выполнять
охлаждение до температуры отжига (т.е.
переходит от шага денатурации к следующему
шагу в профиле).

В
процессе циклирования пик не определяется,
а фиксируется, когда флуоресценция
референсной пробирки достигнет
соответствующего этому пику уровня
(порога). На рисунке ниже показана
исходная кривая плавления и ее первая
производная совмещенные на одном
графике. Рисунок иллюстрирует соответствие
между Порогом Денатурации (Denaure
Threshold)
и Пиком плавления (Melt
Peak),
полученными в ходе такой калибровки.

Чтобы
проводить оптическую денатурацию нужно:

• Поместить
  предварительно амплифицированный
  образец в первую позицию в роторе. Этот
  образец должен содержать продукт
  амплификации, тот же, какой получается
  в образцах при проведении этого анализа,
  и интеркалирующий краситель, позволяющий
  детектировать денатурацию продукта,
  например, SYBR
  Green.

• З

  

  Картинка с сайта: textarchive.ru

  апрограммировать
  соответствующий профиль, где включено
  использование опции оптической
  денатурации

Информация
об установленных параметрах проведения
оптической денатурации появится слева
от окна с графическим изображением
цикла.

Для
выполнения данной функции Вам нужно
войти в Edit
Profile (Редактор профиля)
и, выделив первый шаг в цикле (предназначенном
для денатурации),
выбрать тип шага Optical
Denature
(вместо Timed
Step)
в левой части данного окна. Ниже этой
строки в графе перечислены параметры
калибровки для этой процедуры Calibration
Settings,
заданные по умолчанию (нагревание до
95ºС.
Нажав кнопку Edit
(Редактировать)
Вы можете изменить эти значения (например,
увеличить конечную температуру).

1. Авто—Оптимизация
   параметра
   «gain» / Auto-Gain Optimisation

При
подготовке нового анализа с реакциями,
которые ранее не ставились в приборе
Rotor—Gene
6000,
полезно использовать функцию оптимизации
параметра Gain
(Усиление).
Эта опция позволит Вам установить
значения Gain
для каждого из каналов и установить
температуру оптимизации.

Параметр
Gain для каждого канала может изменяться
от -10 до 10.

-10=наименьшая
чувствительность, 10=наибольшая
чувствительность.

Установки
параметра Gain (Усиление) задаются при
запуске анализа и заданные значения
используются для всех данных по этому
каналу измеряемых в данном анализе.

При
постановке реакции в первый раз
рекомендуется подготовить пробный
образец, содержащий все компоненты
реакции. Этот образец помещают в прибор
и запускают оптимизацию Gain,
чтобы получить наилучшие установки
параметра Gain.

Gain
Auto-Optimisation (Авто-оптимизация параметра
«gain»)

Это
окно позволит Вам провести автоматическую
оптимизацию параметров детекции прибора
для данного анализа путём автоматического
подбора установок параметра Gain
(Усиление)
таким образом, чтобы измерения по всем
избранным каналам не превышали
определенного порога (предела измерения).
Это окно можно открыть нажав кнопку
Gain
Optimisation
(Оптимизация параметра «gain»)
в нижней части окна Channel
Setup Мастера
Старта
(New
Run
Wizard).

Optimise
All
/ Optimise
Acquiring (Калибровать
все
/
Калибровать Детектирующие).
Выбор кнопки Optimise
All
(Калибровать
все)
приводит к попытке откалибровать все
каналы, известные программе. При нажатии
кнопки Optimise
Acquiring (Калибровать
Детектирующие)
будут калиброваться только те каналы,
которые Вы использовали для детекции
в выполняемом температурном профиле
(при циклировании или при плавлении).

Channel
Settings
(Установки
каналов):
Это ниспадающее меню, позволяет Вам
добавить дополнительные каналы в окно
оптимизации Gain.
Выберите интересующий Вас канал и
нажмите кнопку Add
(Добавить)
(справа
в вертикальном ряду кнопок в данном
окне).

Edit
(Редактировать):
Эта кнопка открывает диалоговое окно,
где устанавливается диапазон, в котором
должен находиться флуоресцентный сигнал
пробирки по которой проводится оптимизация
(Target
Sample
Range),
и позицию в роторе пробирки, по которой
проводится оптимизация (Tube
Position).
Процесс автоматической оптимизации
состоит в проведении постепенного
перебора значений параметра «Gain»
и считывания флуоресценции. При этом
выбирается первое значение Gain,
при котором получен флуоресцентный
сигнал, попадающий в заданный диапазон.
В приведенном ниже примере была выбрана
позиция пробирки 1
и диапазон флуоресцентного сигнала
образца от 5
до 10
Fl.

Remove
(Удалить) и Remove all (Удалить Все):
Удаляет выделенные цветом каналы или
все каналы.

Start
(Старт):
Начинает процесс оптимизации. Будет
выбрано значение «gain», при котором
флуоресцентный сигнал находится в
заданном диапазоне. Если ни одно значение,
удовлетворяющее этому условию, не
найдено, то будет выбрано наиболее
подходящее из ближайших значений.

Manual
(Ручная
настройка):
Открывает Экран Ручной Оптимизации
(рассмотрено ниже).

Perform
Optimisation
Before
1st
Acquisition
(Выполнять
оптимизацию перед первым измерением):
Пометка в данной ячейке позволяет
провести оптимизацию параметра Gain
в
ходе первого цикла, когда начинается
измерение флуоресцентных данных. Этот
вариант очень удобен, поскольку в
некоторых образцах после первичной
денатурации может существенно изменяться
фон флуоресценции.

Perform
Optimisation
At
[x]
Degrees
At
Beginning
of
Run
(Выполнять
Оптимизацию при ХС
в начале выполнения анализа): Пометка
в этой ячейке позволяет провести
оптимизацию параметра Gain
непосредственно
перед началом выполнения программы
анализа. Камера прибора нагревается до
заданной температуры, проводится
оптимизация по параметру Gain,
и затем начинается термоциклирование
по заданной программе, начиная с первого
шага (обычно это шаг денатурации). Это
может быть полезно, если оптимизация в
течение первого цикла слишком влияет
на длительность удерживания на температуре
первого шага программы. Однако обычно
оптимальным является использование
варианта Perform
Calibration
Before
1st
Acquisition
(Выполнить оптимизацию перед первым
измерением) поскольку
оптимизация происходит при условиях
максимально близких к условиям дальнейших
измерений сигнала в ходе анализа.

Изменение
Gain
в ходе работы:
Если в начале выполнения анализа был
случайно выбран слишком высокий или
слишком низкий Gain
то его можно изменить в течение первых
десяти циклов. На главном экране появится
вертикальная линия там, где Gain
был изменен. Вследствие изменения уровня
флуоресценции циклы, предшествующие
изменению, будут исключены из анализа.

Хорошими
диапазонами для начального уровня
флуоресцентного сигнала являются
следующие:

• для
  SYBR
  Green
  – от 1 до 3;

• для
  флуоресцентно-меченых зондов (таких
  как «TaqMan»
  или «Beacon»)
  – от 5 до 10;

• для
  системы формата «FRET-гашение»
  – от 70 до 80.

Установка
параметра «gain»
вручную

При
нажатии кнопки Manual
(Ручная) в
окне Auto—Gain
Optimisation
открывается
окно Manual
Gain Adjustment (Ручная регулировка параметра
«gain»),
которое

позволит Вам в реальном времени
просмотреть уровень флуоресцентного
сигнала при любой заданной температуре.
Оно применяется, когда неизвестен фон
образца и, соответственно, параметр
«gain»
необходимо установить так, чтобы сигнал
образца был достаточным для детекции
и не превышал предела шкалы.

По
умолчанию выводятся на экран графики
всех образцов. Можно выбрать нужные
образцы с помощью меню выбора
(включения/выключения) образцов,
расположенного справа от окна графиков,
как это делается и в других окнах
программы.

Требуется
примерно 4
секунды для получения данных с одного
канала. В течение этого времени интерфейс
пользователя не активен, поэтому
оптимальная последова-тельность действий
такова:

1).
Начать тестирование.

2).
Дождаться стабилизации температуры.

3).
Зарегистрировать флуоресцентный сигнал
в конечной точке.

4)
Остановить прибор.

5)
Внести соответствующие изменения
параметра Gain.

6)
Снова запустить прибор.

Температура
(Temperature):
Измените это значение, чтобы установить
температуру прибора. Примечание:
Температура не регулируется во время
выполнения прибором заданной операции.
Чтобы изменить устанавливаемую
температуру, нужно будет заново запустить
выполнение процедуры после того, как
Вы установите требуемую температуру в
соответствующем боксе (Temperature)
на экране.

Edit
Gains
(Редактировать параметр «gain»):
Открывает
окно Редактирования значений Gain.

Start
(Старт):
Запускает работу прибора, устанавливая
температуру в соответствии с той, которая
указана на экране. Появятся графики
температуры и флуоресценции по заданным
каналам.

Stop
(Стоп):
Останавливает работу прибора. Если
прибор все еще получает новые данные,
когда Вы нажимаете на эту кнопку, то
сначала он завершит получение данных,
а затем остановится. Этот процесс может
потребовать до 5 секунд для каждого
канала.

ПРИМЕЧАНИЕ.
Цель
установки параметра Gain
– получить все данные в правильном
диапазоне. Gain
не влияет на Ваши данные. Если был выбран
очень высокий Gain,
то кривые могут выйти за пределы шкалы
и данные будут потеряны. Поэтому разумно
начинать измерения образцов с Sybr
Green I
или с двойной меткой при низком уровне
флуоресценции (поскольку ожидается
прирост), а для образцов в которых
используется FRET-гашение
– при более высоком уровне флуоресценции
(ожидается снижение).

1. Редактирование
   таблицы образцов (Edit
   Samples)

Это
окно функционально идентично редактору
таблицы образцов в Мастере Старта.
Доступ к этому меню также можно получить,
щелкнув кнопку Edit
samples
под цветной таблицей образцов справа
(или после щелчка правой кнопкой мыши
по этой цветной таблице образцов).

В
данном окне Вы вводите данные по всем
анализируемым образцам: положение
пробирки в роторе, название и тип
образца, а также задаете цвет, которым
будут обозначены графики данных для
данного образца.

В
верхней части экрана даются 3 опции
меню: File
(Файл),
Edit
(Редактировать)
и Help
(Помощь).
Меню Файл позволяет создать новый лист
образцов, открыть существующий шаблон
образцов или сохранить названия в
качестве шаблона для дальнейшего
использования. Расширение этих файлов
*.smp.

Given
concentration format
(Формат
заданной концентрации):
Это падающее меню используется для
выбора числового формата, в котором
будут определяться концентрации. В
связи с тем, что в разных странах форматы
обозначают различным образом, для выбора
даны разные форматы.

Unit
(Единицы):
Это падающее меню позволяет выбрать
соответствующие единицы (для определения
концентрации стандартов) для Вашего
анализа.

Edit
(Редактировать):
Нажатие этой кнопки открывает цветную
схему. Избранные образцы (вплоть до 36
или 72)
будут изменены в соответствии с выбранным
цветом. Щелкните ОК

и всем избранным образцам будет присвоен
этот цвет.

Reset
Default
(Переустановка
по умолчанию):
Щелкните
по этой кнопке, чтобы вернуть всем
ячейкам их цвет, заданный ранее по
умолчанию

Gradient
(Градиент):
Функция
градиента позволяет выбрать градиент
от первого к последнему избранному
цвету. При установке образцов могут
быть выбраны несколько градиентов.

New

(Новый
):
Очищает таблицу образцов и подготавливает
к введению данных.

Open
(Открыть):
Выводит диалоговую ячейку, в которой
Вы можете выбрать файл образцов Rotor-Gene
для импорта.

Примечание.
Установки
для 36-луночных
наборов образцов не могут быть
импортированы в 72-луночные
установки и наоборот. Число образцов в
открытом листе и импортируемый файл
должны совпадать.

Save
As
(Сохранить
как):
Выводит диалоговую ячейку, в которую
Вы можете ввести название файла для
сохранения текущих образцов.

Copy
(Копировать):
Копирует
избранные ячейки.

Paste
(Склеить):
Склеивает ячейки, которые были выбраны
командой копировать по отношению к
избранной текущей позиции на сетке.

Excel
:
При нажатии данной кнопки возникает
подсказка для введения названия файла.
Затем автоматически открывается Excel.

Типы
Образцов:

Тип
образца указывается в графе Type.
Существует несколько типов образцов,
которые перечислены ниже:

Unknown
(Неизвестный
образец): Для
неизвестных образцов, которые подлежат
количественному анализу или анализу с
помощью кривых плавления

Standard
(Стандарт):
Образцы с известной концентрацией,
значения концентраций стандартов
используются для построения кривой
стандартов и расчета концентраций
неизвестных образцов

None
(Никакой):
Нет образца в этой позиции

NTC
(No
Template Control):
Негативный контроль без матрицы ДНК

Sample
Pages
(Cтраницы
в таблице образцов):
Эта опция позволяет пользователю по
разному определять одни и те же образцы
в разных страницах таблицы. Пользуйтесь
кнопками со стрелками для передвижения
от одной страницы к другой. Программа
позволяет создать новую страницу кнопкой
New
и
удалить ненужную кнопкой Delete.
Странице можно присвоить имя.

Эта
опция полезна, когда при анализе
необходимо получить несколько кривых
стандартов, измеренных либо на одном
канале (например, Sybr
Green I
или любой другой флуорофор) либо наоборот,
на нескольких каналах (используя до 4
различных флуорофоров).

Given
Conc
(Заданная
Концентрация): Показывает
концентрацию для каждого из определенных
стандартов. Единицы измерения могут
определяться как десятичные или
логарифмические. Если надо впечатать
серии разведений, то необходимо ввести
только первые два стандарта. После
нажатия Enter
программа автоматически добавляет
10-кратную
концентрацию, если ниже определены
дальнейшие стандарты.

Дополнительные
опции (для повышения оперативности
ввода данных):

Автозаполнение:
При введении стандартов, если Вы помещаете
их в последо-вательных пробирках, начните
ввод данных с первой пробирки, затем
нажмите Ввод. Введите вторую концентрацию
и нажмите Ввод. Программа автоматически
спрогнозирует следующую концентрацию
в ряду. Удерживайте нажатую клавишу
ввода для заполнения оставшихся рядов.

Ввод
множества рядов:
Если Вам нужно ввести сходную информацию
для нескольких рядов сразу, выберите
все ряды, затем начните вбивать значения.
Информация будет введена в каждый ряд.
Эта функция работает для выбора типа
образцов, цветов или введения концентраций.

Клавиша
Быстрого Ввода Типа Образцов:
Чтобы быстро выбрать тип образцов,
введите только первую букву её названия.
Так, чтобы установить формат 5
образцов как NTC,
выберите их в столбце типа образцов,
затем нажмите N.
Все образцы будут конвертированы в NTC.

Полное
описание образцов может быть сохранено
как файл последовательности образцов
(*.smp)
и может загружаться в последующие
анализы с той же конфигурацией образцов.

Примечание:
вся
последовательность образцов может быть
отдельно сохранена в виде файла с
расширением *.smp
и загружена в следующие файлы анализа
с такими же образцами.

Роторный
вид Редактора Образцов –
это альтернативная форма редактора
образцов в виде графического изображения
ротора с обозначенными на нем точками
образцами. Он подходит для быстрого
редактирования, когда не нужно вводить
дополнительную информацию помимо
названий (идентификаторов) образцов и
их цветового обозначения. Подробная
информация о образцах может быть введена
с использованием стандартного формата
редактора.

Группы
образцов

Задав
произвольную группу образцов, Вы можете
рассчитывать статистические параметры
внутри этой группы. В отличие от реплик,
которые должны иметь одинаковое
обозначение (название) образца, образцы
группы могут иметь любые имена и
располагаться в любых позициях в роторе,
а также входить в другие группы. Чтобы
определить группу, введите имя группы
в ячейку рядом с типом образца и нажмите
Enter.

Автоматически
появится окно названия группы

Введите
подходящее обозначение и нажмите ОК.
Это обозначение можно использовать,
чтобы формировать группу образцов. Для
группы автоматически рассчитываются
общие параметры, такие как среднее
значение и 95% доверительный интервал.

7. Обзор
основных функций

Данная
глава поможет ознакомиться с элементами
интерфейса Rotor-Gene.

7.1. Рабочее пространство

Рабочее
пространство программы Rotor-Gene
занимает большую часть основного окна.
Это область, в которой Вы можете открыть
графики необработанных данных, температуры
и результатов анализа. Если во время
работы у Вас открыто несколько окон
одновременно, Вы можете организовать
их расположение, щёлкнув по кнопке
Arrange
(Размещение)
в меню программных инструментов.
Существует несколько доступных
дополнительных опций, которыми Вы можете
воспользоваться, щёлкнув по значку
«Стрелка
Вниз»,
который появляется рядом с указанной
кнопкой.

7.2. Панель инструментов

Эти
кнопки обеспечивают быстрое выполнение
наиболее часто используемых операций.
Чтобы увидеть, какова их функция,
задержите курсор мыши поверх клавиши,
после этого появится краткое объяснение.
Доступ к этим командам также может быть
осуществлен через соответствующие
пункты основного меню с теми же
наименованиями.

New
(Новый)
— создать новый файл

Open
(Открыть)
– открыть файл

Save
(Сохранить)
– сохранить файл

Start
(Старт)
– запуск программы

Pause
(Пауза)
– временное прерывание (пауза) выполнения
программы

Stop
(Стоп)
– стоп

Help
(Помощь)
– помощь

View
(Обзор)
– обзор

Exp.
Info
(Эксп. Информация)
– информация об анализе

Progress
(Прогресс)
— ход процесса

Profile
(Профиль)
– профиль термоциклирования и детекции

Temperature
(Температура)
– температура

Samples
(Образцы)
– таблица образцов

Arrange
(Упорядочить)
– упорядочивание открытых окон

7.3. Обзор необработанных данных
различных каналов

Щёлкните
по этим кнопкам, чтобы увидеть данные
различных каналов в открытом файле
анализа.

При
просмотре данных канала можно использовать
различные опции для изменения представления
данных. Можно трансформировать данные
для выполнения каких-либо редко
используемых вариантов анализа данных.

Adjust
Scale
(Настройка
Масштаба Шкалы):
выведет окно, в котором Вы сможете ввести
масштаб вручную или выбрать его
автоматически. Чтобы выбрать эту опцию,
просто нажмите правую кнопку мыши над
соответствующим экраном.

Auto-Scale
(Авто-Масштаб):
автоматически приводит шкалу в
соответствие с максимальными и
минимальными считываемыми данными.

Default
(По
умолчанию):
установит масштаб от 0 до 100 флуоресцентных
единиц.

Символ
гаечный ключ

Щелкая
по изображению гаечного ключа, Вы
получаете доступ к набору инструментов,
упрощающих ручной анализ данных. Доступ
к этим инструментам также может быть
осуществлен при нажатии правой кнопки
мыши в соответствующих экранах.

7.4 Включение / выключение образцов

Используйте
данное средство управления, чтобы скрыть
или показать различные образцы на
экране. Высветленные образцы выключены
(не выбраны). Панель Развёртки
(Прокручивания) используется для вывода
на экран следующих групп образцов. Вы
можете просматривать образцы по
отдельности, щёлкая по ним курсором
мыши, или Вы можете скрыть/показать все
образцы, входящие в часть таблицы
образцов, которая видна на экране (их
количество зависит от пространства
экрана), щёлкнув по кнопке Bank
on / Bank off (включить/выключить группу).
Чтобы выбрать ряд образцов, щёлкните
курсором мыши на первом образце и
протащите мышь до последнего выбираемого.
Когда Вы отпустите кнопку мыши, то
выбранные образцы будут либо выделены,
либо выключены. Щёлкнув по кнопке Named
On (Включить именованные),
Вы сможете увидеть только те образцы,
которым Вы присвоили имя; это быстрый
способ показать только отдельные
необходимые образцы. Щёлкая по кнопке
All
On / All Off
(Все
включены / Все выключены),
Вы можете увидеть / вылючить все 36
или 72
образца. Нажатие на кнопку Edit
Samples (Редактировать образцы)
открывает окно редактирования таблицы
образцов.

Вывод
образцов на экран
— если используется 72-луночный
ротор,
то образцы показываются от А1
до А8,
от В1
до В8
и т.д. Использование кнопки вывода
иденти-фикаторов образцов на экран
позволяет пользователю переключиться
на формат таблицы образцов, при котором
указывается порядковый номер образца
в роторе от 1
до 72.

Select
Groups
(Выбрать группы): Если
в таблице образцов (в окне Edit
Samples)
были определены группы, то эта опция
позволит выводить на экран отдельно
группу образцов из активизированной
страницы. Группа – это произвольно
объединенное множество образцов, при
объединении которых можно получить
дополнительные отчеты по статистическим
результатам.
Например, можно определить группу
образцов от пациентов, получавших
терапию, и группу образцов от не
проходивших лечение пациентов

7.5 Меню Файлов / File

Новый
/ New

При
выборе в меню New
открывается окно New
Run.
Это окно предоставляет Вам возможность
воспользоваться широко используемыми
шаблонами, собранными в списке шаблонов
Мастера Быстрого Старта Quick
Start
или
Детального Мастера Старта
Advanced.
После выбора Мастера, его последовательно
открывающиеся окна проведут пользователя
по всем параметрам, которые нужно
определить, чтобы запрограммировать
выполнение определенного вида анализа.
Информация о шаблонах представлена в
разделах «Мастер Быстрого Старта» и
«Детальный Мастер Старта» (Глава 6).

Активные
кнопки окна New
Run:

New:
запускает
Мастер для создания программы анализа
на основе выбранного шаблона.

Cancel
(Отменить): Закрывает
это окно.

Help
(Помощь): Открывает
окно помощи.

Show
this
screen
when
software
opens:
Если
эта опция отмечена галочкой, то окно
New
для запуска нового анализа будет
автоматически открываться, когда
открывается программа Rotor—Gene.

Опции
Открыть файл, сохранить файл / Open,
Save
as

При
обращении к меню File
становятся
доступными перечисленные ниже опции.

Open…
(Открыть): Позволяет
открыть ранее сохраненный файл с данными
анализа Run
File
(.rex)
или архивный файл Run
Archive
(.rea
file).

Open
Recent…(Открыть
последние…): Показывает
список последних четырех файлов, которые
открывали или сохраняли

Save
(Сохранить): Сохраняет
файл с внесенными в него изменениями

Save
As…(Сохранить
как…):
Позволяет сохранять файл в различных
форматах, например, как шаблон для
последующих запусков анализа. Возможные
форматы следующие:

Run
File…(Файл
данных анализа): Сохраняет
копию данного файла. Можно изменить имя
или директорию, в которой сохраняется
файл. Этот формат выбирается по умолчанию.

Template…(Шаблон):
Сохраняет
файл, как шаблон для последующих запусков
такого же анализа, с заданным профилем
термоциклирования и детекции и некоторыми
другими установками, но без данных
анализа.

Run
Archive…
(Архивный файл): Сохраняет
в наиболее компактном формате. Следует
сохранять в таком формате файлы, которые
Вы хотите отправить по E-mail.
Это упростить пересылку файла и защитит
его.

Excel
Data
Sheet…(Excel
Лист Данных): Экспортирует
все необработанные данные по всем
каналам в лист Excel.
При этом экспортируются данные только
выделенных образцов.

Excel
Analysis
Sheet…
(Excel
Лист Анализированных Данных): Экспортирует
все данные анализа в один лист Excel.

LinReg
Export
Format…(Экспорт
в формат LinReg):
Экспортирует
все необработанные данные в формат
распознаваемый программой LinReg.
См. раздел «Экспорт в LinReg»
для получения дополнительной информации.

Matlab
Export…
– Экспорт в формат, распознаваемый
пакетом научных программ Matlab
(или его эквивалент в свободном доступе,
Octave).
Эта опция полезна для научных исследований.

Экспорт
в формат LinReg
/ LinReg
Export
Format

Программа
LinReg
– это приложение, разработанное авторами
публикации: «Assumption-free
analysis
of
quantitative
real-time
polymerase
chain
reaction
(PCR)
data.»

Ramakers
C, Ruijter JM, Deprez RH, Moorman AF. Neurosci
Lett. 2003 Mar 13;339(1):62-6.

Краткое
содержание статью можно найти по адресу:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=12618301&dopt=Abstract

Эта
программа предоставляется по запросу

(e-mail:
bioinfo@amc.uva.nl;
subject:
LinRegPCR).

Чтобы
импортировать в формат LinReg
данные из программы Rotor-Gene
откройте файл с данными, выполните выбор
опции Save
As…,
затем LinReg
Export
Format
как
показано на рисунке.

Опция
Reports…
(Отчеты)

Опция
Reports…загружает
окно формирования отчетов. Если данные
ранее уже были проанализированы, то
можно вывести отчет о результатах
непосредственно через данную опцию, не
обращаясь вновь к модулю анализа. Можно
получать разные формы Отчетов, содержащих
более или менее подробную информацию.

Опция
Setup…
(Установки)

Установки
программы задаются пользователем в
процессе ее инсталляции. Однако после
этого Вы можете изменить их с помощью
данного окна Setup

Virtual
Mode
(Виртуальный
режим) : отметьте
галочкой эту опцию, если программа будет
использоваться без подключения прибора
Rotor—Gene
для анализа данных, создания шаблонов
или демонстрации. Все функции программы
будут активны.

Port
(Порт): Выберите
правильно, какой последовательный
(COM)
порт используется.
Если
Вы не уверены, какой порт выбрать,
используйте автодетекцию Auto—Detect.

Allow
access
to
this
screen
(Сохранить возможность доступа к этому
экрану): Если
не отметить галочкой эту опцию, то
впоследствии Вы не сможете обращаться
к этому окну. Чтобы восстановить доступ
нужно будет обратиться к дистрибьютеру.

8.
Меню Анализа данных / Analysis

8.1 Панель инструментов меню
Analysis
(Анализ).

Выбор
меню Analysis
в
главной панели инструментов открывает
окно панели инструментов меню анализа
данных.

Эта
панель инструментов позволяет Вам
провести новый анализ, выбрав его формат,
или вывести на экран уже существующие
результаты. Кнопки вверху окна позволяют
Вам выбрать метод проведения анализа.
Как только Вы выбрали метод, ниже
перечисляется список каналов, которые
могут быть проанализированы данным
методом. Рядом с теми каналами, данные
которых уже были ранее проанализированы,
появится зелёная отметка (галочка). Это
означает, что для данного анализа
сохранены в памяти установки уровня
порога и нормализации. Чтобы проанализировать
данные канала или включить обзор данных
канала, щелкните дважды по его названию.
После этого откроется специальное окно
анализа.

Auto—shrink
Window
(Авто-сворачивание
окна) –
отметка в данной графе означает
сворачивание
окна, если оно не используется. Перемещение
курсора над окном вновь разворачивает
его.

Организация
Вашего рабочего пространства
(Arrange)
–
всякий
раз, когда Вы двойным щелчком мыши
начинает новый анализ, окно будет
организовано в соответствии с тем видом,
которое уже выведено на экран. Эту
функцию сложно использовать, когда
открыто много окон. Просто закройте те
окна, которые Вам не нужны, затем нажмите
на панели кнопку Arrange
(Организовать).
Данное
окно будет автоматически реорганизовано
в соответствии с методом «Smart
Tiling»
(Умное
управление окнами).
Вы
можете выбрать другой метод организации,
щёлкнув по значку стрелки вниз рядом с
кнопкой Arrange
панели инструментов.

Щелчок
правой кнопкой мыши по окну анализа
также позволяет «Показать»
(Show),
«Скрыть»
(Hide)
или
«Удалить
Анализ» (Remove).

8.2 Количественный
анализ – Quantitation Analysis

Выбрав
меню Analysis,
щёлкните дважды по кнопке Quantitation
(Количественный
Анализ)
или нажмите кнопки Quantitation
и
Show
(Показать),
чтобы открыть анализ данных интересующего
Вас канала. Автоматически могут быть
открыты сразу три окна: основное окно
Quantitation
Analysis,
окно Standardt
Curve (Кривая Стандартов)
и окно Quant.
Results (Таблица результатов).
В основном окне в панели инструментов
слева направо имеются следующие кнопки:
Reports
(Отчет), Std Curve (Кривая
Стандартов),
Results (Результаты), Dynamic Tube (Динамический
фон пробирки), Slope Correct (Корректировка
наклона кривой), Ignore First (Игнорировать
первые циклы) и
Outlier
Removal
(Удаление Выбросов), использование
которых рассмотрим далее.

Основное окно
количественного анализа

В
этом окне показаны кривые амплификации
(кривые флуоресценции) после соответствующей
обработки данных
(определяется средний фон флуоресценции
для каждого образца, производится
вычитание фона и нормализация данных,
которые затем конвертируются в
логарифмическую шкалу).

Детально
обработка данных определяется с помощью
опций, представленных в меню основного
окна (над графиками).

По
графикам кривых амплификации в
логарифмическом масштабе, которые Вы
увидите, как только откроете окно
количественного анализа, можно определить
нужный уровень пороговой линии и,
установив ее, определить значение Ct
(порогового
цикла) для каждого образца. Значение Ct
определяется как цикл на котором кривая
флуоресценции данного образца пересекает
пороговую линию, оно характеризует
начало логарифмической фазы амплификации.
Это значение Ct
при
соответствующем уровне порога напрямую
соответствует стартовой концентрации
ДНК-мишени в образце (значение Ct
пропорционально логарифму стартовой
концентрации).

Нажатие
кнопки Linear
Scale
(Линейная
Шкала)
внизу экрана переведёт из Логариф-мической
Шкалы к Линейной Шкале.
Обратно к логарифмической шкале можно
переключиться снова щелкнув по той же
кнопке с названием Log
Scale
(Логарифмическая
Шкала)

Различие
между Линейной
и Логарифми-ческой
Шкалой
заключается только в способе графического
представления данных, но не в расчетах.
Логарифмическая Шкала визуально
увеличивает участок графиков,
соответствую-щий началу логарифмической
фазы амплификации (вблизи нуля). Линейная
Шкала представляет те же нормализованные
данные. Это можно легко проверить,
включив точечный указатель (опция Show
Pinpointer)
на обоих графиках и сравнив полученные
значения флуоресценции. Можно увидеть,
что между фактическими данными нет
различий.

ПРИМЕЧАНИЕ.
Эти
процедуры можно осуществить во время
работы Ротор-Джин. Такой мониторинг
количественных данных в режиме реального
времени обеспечивает пользователю
возможность получения результатов
сразу, как только начинает определяться
экспоненциальный рост кривых. Можно
сразу сделать предварительные заключения
и принять решения, касающиеся следующего
эксперимента.

Reports
(Отчёты):
Открывает окно выбора количественных
отчётов, где Вы можете выбрать отчёт
для предварительного просмотра избранного
количественного анализа. Существуют
три различные опции: Standard
Report (Стандартный отчёт), Full Report (Полный
отчёт) и Concise Report (Краткий отчёт).

С
помощью кнопок, расположенных вверху,
отчёт может быть Распечатан
(Print),
Сохранен
(Save),
Отправлен
по электронной почте (Email)
или экспортирован
в
Word
(To
Word).

Кривая
Стандартов / Standard curve

Std.
Curve
(Станд.
Кривая):
Эта кнопка открывает график кривой
стандартов, на основании которого
выполнен расчет концентраций ДНК-мишени
в образцах. По умолчанию это окно
открывается при выполнении количественного
анализа. Если Вы закроете данное окно,
оно может быть повторно открыто с
использованием этой кнопки в основном
окне количественного анализа.

Значения
параметров кривой стандартов
пересчитываются в динамическом режиме,
если изменять уровень пороговой линии
(с помощью щелчка по ней и перетаскивания
мышью).

Синие
точки
на кривой соответствуют данным образцов,
которые были определены как стандарты,
а красные
точки
показывают данные неизвестных
(анализируемых) образцов.

Примечание.
При
повторном определении стандартов с
целью пересчитать кривую
стандартов выключение
или включение стандартных образцов
(цветом) соответственно удалит их данные
из расчёта кривой
стандартов
или добавит их.

Удаление
стандартов для улучшения значения R²
не обосновано, поскольку снижается
достоверность полученных результатов.
(Наличие стандартов, для которых
полученное значение CT не соответствует
кривой стандартов, свидетельствует,
что значения, полученные для анализируемых
образцов также могут быть не корректными).

R2-value
(R²-значение,
коэффициент корреляции):
коэффициент R²
для кривой стандартов показано в правом
верхнем углу каждого окна кривой
стандартов.

R²–
это число (в диапазоне от 0
до 1),
которое представляет, насколько хорошо
линия наибольшего соответствия описывает
зависимость между двумя переменными.
Иначе говоря, характеризует процент
данных, согласующихся со статистической
гипотезой, что зависимость между
концентрацией и CT
для данных стандартов описывается
данной линией кривой стандартов.
R-значение,
равное 0,
подразумевает, что линия не описывает
это взаимоотношение. Коэффициент R,
равный 1,
показывает, что значения данных попадают
прямо на линию наибольшего соответствия,
и, следовательно, эта линия даёт хорошее
описание зависимости между двумя
переменными. Хорошие значения коэффициента
R²
составляют около 0,99.

Замечание:
Можно
достигнуть высоких значений R²
для
стандартной кривой построенной по
недостаточному объему данных, если было
использовано недостаточное количество
стандартов. Значение R²
улучшается при уменьшении числа
используемых стандартов, однако это не
увеличивает достоверность полученных
результатов.

В
соответствии с формулой y
= mx + b
параметры наклон
М
и отрезок В
для кривой стандартов рассчитаны
автоматически и показаны в правом
верхнем углу окна кривой стандартов.

Наклон,
Амплификация, Эффективность Реакции
(Slope, Amplification, Reaction efficiency):
Наклон
(m)
реакции (показанный в окне кривой
стандартов) может быть использован для
вычисления величин экспоненциальной
амплификации и эффективности реакции
с помощью следующих уравнений:

Экспоненциальная
амплификация = 10 ^{(-1/наклон)}
или

Эффективность
реакции = [10^{(-1/наклон)}]-1.

Оптимальные
значения для наклона, амплификации и
эффективности реакции равны

–3,322;
2 и 1,
соответственно. Эффективность реакции
указывается в количественном отчёте.

Наклон
рассчитывается делением изменения
величины Ct
на изменение логарифма входных данных
(например, количество копий). Эффективность
амплификации 100%
означает удвоение продукта амплификации
в каждом цикле, результатом чего являются
наклон, равный –3,322,
фактор амплификации, равный 2,
и эффективность реакции, равная 1.

При
наклоне равном –3,322,
расчеты будут следующими:

Величина
амплификации: 10 ^(-1/-3,322)
= 2,

Эффективность
реакции: [10^(-1/-3,322)]-1
= 1.

Далее
приводятся два примера для двух различных
значений наклона.

Величина
наклона, равная —3,8,
означает, что реакция характеризуется
величиной амплификации примерно 1,83
и эффективностью реакции 0,83
(или 83%).

Для
такой величины может быть несколько
причин. Если эту величину необходимо
улучшить, то можно предпринять такие
шаги по оптимизации, как изменение
концентрации праймеров или зонда,
концентраций MgCl₂
или Sybr-Green
I.

Наклон,
равный —3,
означает, что эффективность реакции
более 100%.
Причиной этого может быть непропорциональное
расщепление зонда по отношению к
наработанному количеству ампликона. К
тому же, если R-значение
низкое, то статистическая ошибка может
вызвать неправильное значение
эффективность реакции.

Export
Graph…
(Экспорт
графика в графическом формате):
Щёлкните
по правой кнопке мыши на кривой стандартов,
чтобы обозначить опцию сохранения
графика кривой стандартов в графическом
формате (например, JPEG,
или GIF).

Overlay
(Наложение).
Когда одновременно в одном приборе
проводят несколько количественных
анализов можно совместить несколько
кривых стандартов в одном окне. Эта
функция полезна для того, чтобы
представить влияние разного уровня
пороговой линии на статистические
параметры результатов. Ниже представлен
пример.

Расчет кривой
стандартов

«conc=…*CT
+ …»
Данное уравнение описывает соотношение
между значениями СТ
и концентрациями ДНК-мишени.

Тип
кривой (Type)
может
быть либо плавающим (Floating), либо
фиксированным (Fixed). При плавающем типе
уравнение оптимальной стандартной
кривой вновь рассчитывается, как только
Вы меняете порог. При фиксированном
типе уравнение не
изменяется.
Эта опция (фиксированного типа) полезна,
если Вы повторно используете кривую
стандартов в нескольких анализах,
импортируя ее (см раздел Import
Curve).

Меню
CT-Calculation
(Расчет значений
CT):
Значение
CT
образца соответствует значению цикла,
при котором кривая амплификации
(флуоресценции) образца пересекает
пороговую линию. Значения CT
для каждого образца определяются
посредством установки положения
пороговой линии и расчета точки ее
пересечения с кривой флуоресценции
этого образца.

Меню,
используемое для того, чтобы определить
уровень пороговой линии или включить
автоматический поиск уровня порога для
расчета Сt
и кривой стандартов, находится в правой
нижней части экрана, под цветной таблицей
обозначения образцов. Если Вы не видите
эти опции после нажатия кнопки Std.
Curve,
щелкните правой кнопкой мыши в основном
окне Quantitation
Analysis,
чтобы они появились.

Threshold
(Порог)
(Ручная
установка):
Чтобы установить порог, щёлкните по
символу (сетка
с красной стрелкой)
в строке Threshold,
затем нажмите клавишу мыши на графике
и перетащите пороговую линию на желаемый
уровень или введите значение уровня
порога в текстовом окошке в строке
Threshold.
При ручной установке для количественного
анализа следует выбирать уровень
соответствующий экспоненциальному
участку кривых амплификации (флуоресценции).
При использовании Логарифмической
шкалы
Log
Scale в
нижней панели в основном окне, которая
установлена по умолчанию, это соответствует
линейному участку кривых флуоресценции.
При этом уровень пороговой линии должен
значительно превышать уровень фона.

В
качестве альтернативы можно использовать
функцию Auto-Find
Threshold
(Авто-Поиск
Порогового Значения)
для автоматической установки оптимального
уровня.

Auto-Find
Threshold (Авто-Поиск
Порога):
Функция автоматического поиска порога
просканирует затемнённую область
графика, для выбора уровня порога при
котором получаются оптимальные
статистические параметры для
образцов-стандартов (с заданными
концентрациями). Вы можете изменить
область сканирования, введя новые
верхнюю и нижнюю границы в текстовых
графах. В большинстве случаев подходит
область, заданная по умолчанию. Основываясь
на данных, полученных для заданных
стандартов, автоматически сканируется
ряд пороговых уровней, чтобы получить
наиболее подходящую кривую стандартов
(то есть, кривую, для которой получено
максимальное значение коэффициента
корреляции R,
приближающееся к 1.0).

Eliminate
Cycles before
(Не
учитывать предшествующие циклы до):
Щёлкните по символу (решётка
с красной стрелкой),
затем щёлкните на графике, удерживайте
щелчок и перетащите пороговую линию
вправо. При этом из расчетов исключаются
пересечения пороговой линии для
начальных циклов. Задать число, не
учитываемых начальных циклов можно
также введя численное значение в окошке
в строке Eliminate
Cycles before (Не учитывать начальные циклы).

Примечание.
Это
полезно, когда существует шум (случайные
флуктуации) сигнала в ходе первых
циклов.

Import
Standard Curve (Импортировать
Кривую
Стандартов):
Чтобы
импортировать кривую стандартов из
другого файла анализа или кривую,
полученную для другого канала, щёлкните
по кнопке Import
Curve (Импортировать кривую)
в правой нижней части экрана. Тип кривой
будет фиксированным. Нажмите кнопку
Reset
(Переустановка),
чтобы
обратно изменить тип кривой на плавающий.
Ниже показано окно Import
Standard
Curve

Используя
этот экран, Вы можете импортировать
кривую стандартов из другого канала,
который Вы уже проанализировали в ходе
данного анализа, выбрав опцию Current
Run
(Текущий
анализ),
или можете загрузить кривую стандартов
из
другого
анализа, выбрав опцию
From Other Run.

Current
Run
(Текущий
анализ):
После
выбора этой опции, в тестовом поле
Channels
(Каналы)
будут перечислены количественные
анализы на других каналах с их
соответствующими формулами кривых
стандартов.

From
Other Run
(Из
другого анализа):
Выбор
этой опции вызовет появление окна, в
котором Вы сможете выбрать, какой файл
с данными анализа использовать. Если в
этом файле был выполнен какой-либо
количественный анализ, Вы увидите
перечисленные кривые стандартов для
каждого проанализированного канала.

Channels
(Список
каналов):
Перечисляет проанализированные каналы
и соответствующие им формулы стандартных
кривых.

From
External
Source
(Из внешнего источника): воспользовавшись
этой опцией, Вы можете напрямую ввести
значения параметров М и B
для формулы кривой стандартов.

Invert
Raw Data (Перевернуть графики исходных
данных)

Для
некоторых форматов реакции ПЦР c
флуоресцентной детекцией, таких как

«FRET-гашение»
или зонды Bodipy(R),
в процессе реакции происходит снижение
флуоресцентного сигнала, а не его
увеличение. Для анализа таких данных
можно использовать данную опцию, пометив
галочкой бокс Invert
Raw Data.
Для всех других видов анализа эта опция
не должна быть помечена.

Таблица
Результатов / Results

Results
(Таблица
Результатов):
Эта кнопка в меню открывает таблицу
результатов количественного анализа.
По умолчанию это окно открывается, когда
Вы выполнили анализ Quantitation.
Если Вы закроете его, то это окно может
быть повторно открыто с помощью этой
кнопки в меню основного окна количественного
анализа. В таблице результатов в
соответствующих столбцах указываются
полученные значения соответствующего
параметра для каждого из образцов. В
таблице ниже можно видеть столбцы,
содержащие значения следующих основных
параметров: Ct
(пороговый цикл), Given
Conc.
(Заданная концентрация) для
образцов-стандартов, Calc.
Conc.
(Вычисленная концентрация) для
всех образцов, CV
(коэффициент вариации), Ct
Std
Dev
(Стандартное отклонение Ct)
и
некоторые другие статистические
параметры (значение которых рассмотрено
далее).

Получаемые
результаты анализа суммируются в
таблице. Щелчок правой кнопкой мыши
позволяет экспортировать таблицу в
Excel
(Export
to
Excel).
Нет необходимости предварительно
открывать программу Excel,
поскольку это будет сделано автоматически.
Также можно вставить данные в уже
существующий лист Exсel,
если выделить нужную часть таблицы
результатов и воспользоваться опцией
Copy,
а затем вставить в нужные ячейки
листа Excel.

Важное
примечание: пользователь
может выбрать, какие колонки таблицы
результатов показывать, а какие убрать,
щелкнув правой кнопкой мыши по заголовкам
колонок, и в спустившемся меню отмечая
галочкой нужные ему параметры (сняв
галочку, соответственно, можно убрать
данные из таблицы).

Объяснение
обозначений статистических параметров
в таблице результатов.

%
Var:
Коэффициент вариации между рассчитанной
и заданной концентрацией.
%Var
= Abs(Calc.
Conc. / Given Conc. – 1)х100%

Rep
Ct:
Среднее значение Ct
для всех образцов с тем же названием
(именем)

Rep
Ct:Std
Dev.
:
Стандартное отклонение Ct
для группы всех образцов с тем же
названием.

Rep
Ct
95% C.I.:
95% доверительный интервал для значений
Ct
группы образцов с тем же названием. Это
стандартно используемый при количественных
анализах статистический показатель.
Его величина может быть уменьшена при
увеличении количества реплик образца
или при меньших вариациях данных по
образцам-репликам.

Rep
Calc
Conc:
Расчетная концентрация для группы
образцов с тем же названием (именем).
Это не среднее расчетных концентраций
каждого из образцов, а скорее геометрическое
среднее, что является более точной
оценкой для этой величины.

Rep
Calc
Conc
95% C.I.:
95% доверительный интервал для величины
концентрации для группы образцов с тем
же названием. Учитывает как 95% доверительный
интервал концентрации каждого образца,
так и модель линейной регрессии, на
которой базируется расчет. Его можно
интерпретировать так: диапазон
концентраций, которые можно получить
в 95% случаев, когда выполняется такой
же анализ для этих образов при таких же
вариациях. Это консервативная оценка
и полученная величина диапазона может
быть довольно большой, из-за вариаций
присущих любому Real-time
ПЦР-анализу. Диапазон может быть большим,
если значительны вариации между
образцами, используется малое количество
реплик, или если концентрации образцов
далеки от концентраций образцов-стандартов.

ВАЖНО:
Вариации, описанные здесь, не связаны
с точностью прибора
Rotor-Gene
6000, но присущи параметрам процесса
экспоненциальной амплификации c детекцией
в режиме реального времени. При проведении
аналогичных тестов на других приборах
для Real-time
ПЦР Вы можете получить даже большие
показатели вариаций, из-за меньшей
однородности температуры в блоке. При
перекрестном сравнении результатов,
полученных на разных приборах, используйте
величину стандартного отклонения Ct,
это поддерживается всеми основными
производителями.

Чтобы
облегчить расчеты, введена функция,
которая называется Statistics
(Статистика)
и автоматически подсчитывает следующие
параметры для выделенных образцов: Mean
(Среднее),
Std.Dev.
(Standard
deviation – Стандартное Отклонение), Min
(Минимальное значение)
и Max
(Максимальное значение).
Просто поместите мышь поверх интересующей
Вас области ячеек, и значения статистических
параметров выделенной группы образцов
будут даны в меню Statistics
в правой нижней части окна (под таблицей
образцов). В данном случае, приведенном
на рисунке, были проанализированы
значения Ct
образцов c
7 по
9.
Если интересующие Вас образцы не
расположены один под другим, то выключите
разделяющие их образцы в панели
включения/выключения образцов.

Основные
опции обработки данных меню Quantitation
Analysis

Опции
обработки данных представлены в панели
инструментов в окне Quantitation
Analysis
(над
графиками нормализованных кривых
флуоресценции).

Dynamic
Tube (Динамический
фон пробирки):
Эта опция включена по умолчанию и
используется, чтобы установить средний
фон каждого индивидуального образца
на участке, предшествующем логарифмическому
участку кривой амплификации. Стандартная
Нормализация просто рассматривает
значения флуоресценции в первых пяти
циклах как индикатор уровня фона

каждого образца. Все значения
флуоресцентного сигнала, полученные
от данного образца, затем делятся на
это значение фона, чтобы нормализовать
данные. Эта операция повторяется для
всех образцов. Этот способ может быть
не вполне точным, поскольку уровень
фона в течение первых пяти циклов иногда
не может быть хорошим показателем фона
непосредственно перед логарифмической
фазой амплификации. При включении опции
«Динамический Фон Пробирки» используется
вторая производная кривой каждого
образца, чтобы установить для него
стартовый номер цикла. Затем уровень
фона образца определяется как среднее
значений сигнала от первого цикла до
этого стартового цикла. Этот
метод даёт наиболее точные количественные
результаты.
В качестве альтернативы для некоторых
данных может быть необходимо отключить
опцию Dynamic
Tube.
В этом случае средний уровень фона будет
подсчитываться только за первые 5 циклов.
Если фон не является постоянным в течение
всех циклов перед логарифмической фазой
амплификации, то данные будут менее
точными.

Slope
Correct
(Коррекция
наклона):
В идеальном случае фоновая флуоресценция
(Fl)
образца перед началом логарифмической
фазы амплификации должна оставаться
постоянной. Однако иногда уровень
флуоресценции повышается или снижается
за счёт происходящих химических реакций
и вызывает скошенный уровень помех.
Опция «Коррекция Наклона помех»
использует наиболее подходящую линию,
чтобы аппроксимировать уровень искажений
(вместо среднего значения) и проводит
нормализацию с учетом помех. Включение
этой функции может улучшить статистические
параметры данных (уменьшить разброс),
если базовая линия образца заметно
наклонена.

Эта
функция улучшает данные, когда очевидно,
что фон необработанных данных скошен
вверх или вниз перед участком
логарифмической фазы амплификации,
иначе говоря, когда по данным видно, что
фон кривой флуоресценции ползёт вверх
в течение первых циклов.

Ignore
First
(Пренебречь
первыми):
Иногда данные первых нескольких циклов
не репрезентативны по отношению ко всей
кривой флуоресценции при количественном
анализе. Поэтому Вы можете получить
более точные результаты, если Вы выберете
опцию Ignore
First, чтобы
пренебречь данными нескольких первых
циклов. Если фон в первых циклах не
отличается от последующих, то можно
получить лучшие результаты, если
отключить эту функцию, поскольку алгоритм
нормализации будет обрабатывать большее
количество данных. Вы можете установить
число циклов, которыми следует пренебречь.

Outlier
Removal
(Удаление Выбросов):
Эти установки на экране количественного
анализа позволяют дифференцировать
образцы с минорными неспецифическими
изменениями флуоресценции от образцов,
в которых подлинно регистрируется
амплификация ДНК-мишени. Вызвать эту
функцию можно с помощью кнопки Outlier
Removal
(Удаление Выбросов) в
панели инструментов главного окна
экрана количественного анализа. При
этом можно выбрать один из двух механизмов
такой дискриминации: опцию NTC
Threshold
(Порог уровня флуоресценции NTC
контролей)
или
опцию Reaction
Efficiency Threshold
(Порог
эффективности
реакции).
(Примечание:
в предыдущих версиях программы опция
NTC
Threshold
вызывалась с помощью кнопки MoreSettings
в
панели инструментов).

NTC
Threshold
(Порог уровня флуоресценции NTC
контролей):
Эти
установки на экране количественного
анализа позволяют исключить образцы
или контрольные образцы NTC
(контроли без ДНК матрицы), которые имеют
небольшой сдвиг флуоресценции вверх
за счёт деградации зонда или других
эффектов. Для каждого образца
рассматривается изменение абсолютной
флуоресценции, выраженное в процентах
относительно максимального изменения
флуоресценции среди всех образцов. Все
образцы, для которых это изменение
флуоресцентного сигнала ниже порога
NTC
Threshold,
не включаются в таблицу результатов
количественного анализа (рассматриваются
как отрицательные).

Например,
если у вас есть один образец с максимальным
увеличением флуоресцентного сигнала,
для которого начальный фон составлял
2FI,
а в конце его флуоресценция достигла
47FI,
тогда 45FI
представляется как 100%. Если выбрать
равный 10% NTC
Threshold,
то 10% от сигнала будет расцениваться
как фон (шум сигнала) т.е. для данного
примера шумом будет считаться любой
сигнал флуоресценции меньше чем 4,5 FI.

Reaction
Efficiency Threshold
(Порог
эффективности
реакции):

Это
альтернативный метод исключения
образцов, для который подъем флуоресценции
обусловлен неспецифически и является
«шумом» сигнала. Этот нормализующий
алгоритм использует технику оценки
эффективности реакции, применяемую для
Сравнительного Количественного Анализа
(Comparative Quantitation). При этом исключаются из
таблицы результатов все образцы, для
которых эффективность реакции ниже
определенного уровня. Эффективность,
равная 0%, означает, что в логарифмической
фазе не происходила специфическая
реакция, а эффективность, равная 100%,
означает, что реакция происходила с
максимальной эффективностью. Отрицательное
значение эффективности означает, что
флуоресценция образца снижалась, такие
образцы, естественно, следует исключать
из таблицы, поскольку в них не происходила
специфическая реакция.

В
настоящее время нет согласованных
данных о том, какой уровень эффективности
реакции позволяет правильно различать
специфическую реакцию и посторонние
эффекты. Поэтому мы рекомендуем применять
эту опцию с осторожностью, иначе можно
аннулировать результат реакции для
образцов с невысокой эффективностью
реакции, которая, тем не менее, является
подлинной (специфической).

В
любом случае, применение этой опции
невозможно, если нет сильного нарастания
флуоресцентного сигнала для образцов,
в которых действительно протекает
реакция. При использовании некоторых
форматов реакции (например, LUX-праймеры),
степень нарастания флуоресценции
недостаточна, чтобы применять данную
опцию. В каждом случае это требует
проверки.

Шаблон
Количественного Анализа данных

Пользователь
может сохранить в виде шаблона настройки
нормализации кривых и выбранный уровень
порога для анализа, экспортированные
с помощью кнопки Export
в файл с расширением .QUT.
Этот файл можно импортировать кнопкой
Import
и использовать для приложения такого
же анализа данных в других файлах
анализа.

8.3 Относительный Количественный
Анализ по Двум Кривым Стандартов

Анализ
Относительной Экспрессии генов с
использованием Гена Нормализации может
быть выполнен с помощью Анализа по Двум
Кривым Стандартов. Для этого в меню
используют кнопку 2
Std
Curves
(Rel).

Метод
основан на построении для каждого из
генов своей кривой стандартов. По кривой
стандартов для каждого из генов
вычисляется его концентрация. Экспрессию
Гена-Мишени выражают в виде нормализованном
по концентрации Гена Нормализации,

в
качестве которого обычно используют
один из «генов домашнего хозяйства»
(housekeeping
gene).

Здесь
важно правильно определить образцы в
таблице образцов, чтобы образцы-стандарты
и реплики правильно идентифицировались.
Если для анализа используется один
канал, то образцы задают в таблице,
состоящей из двух страниц: одна для
образцов Гена-Мишени, вторая для Гена

Нормализации.

Выполнение
Относительного Анализа по Двум Кривым
Стандартов.

Сначала
нужно проанализировать данные по каждому
гену с помощью Количественного анализа
Quantitation.
Если
это не сделано, то автоматически такой
анализ будет выполнен с использованием
опции Авто-выбора уровня Порога.

Далее
в
меню
Analysis
выберите
2
Std Curve (Rel) и
в
окошке
щелкните
New
Analysis. Введите
имя анализа.

Обозначьте
какие страницы, используются для каждого
из генов. Дополнительно можно использовать
образец-калибратор (Стандарт). При
использовании образца Стандарта, его
концентрация принимается за 1 и для всех
остальных образцов результаты
представляются нормированными
относительно этого стандарта.

Требуется
обозначить по каким данным (какого
канала) выполняются расчеты для
Гена-Мишени (Gene
of
Interest)
и для Гена Нормализации (Normaliser).
Для этого, щелкнув кнопкой мыши, поставьте
галочку в строке Gene
of
Interest
Standard
Curve
и
в появившемся окне выберите нужный
вариант, соответствующий каналу и
странице в таблице образцов для
Гена-Мишени, и нажмите кнопку Select.
Аналогично
выполните выбор данных для Гена
Нормализации, поставив галочку в строке
Normalise—r
Standard
Curve.
Если нужно, то обозначьте образец-калибратор,
пометив галочкой бокс в строке Calibrator
Defined
(опционально).
Если назначен образец-калибратор, то
результаты по всем образцам будут
представлены относительно этого образца,
результат которого принимается за
единицу.

После
выбора нужных данных соответствующая
опция будет отмечена галочкой.

Нажмите
кнопку Reports,
откроется окно браузера Reports
Browser.
Выберите нужный вид анализа и нажмите
кнопку Show,
чтобы получить отчет о результатах.
Выбрав кнопку Export,
Вы можете экспортировать результаты в
лист Excel.

В
последнем окне подготовки отчета будет
представлена таблица результатов,
включающая для каждого образца
рассчитанные по кривой стандартов
концентрации Гена-Мишени (колонка GOI
Conc.)
и Гена Нормализации (Norm.
Conc.),
а также относи-тельную концентрацию
(Relative
Conc.).
Результаты можно сохранить в файл Word.

8.4 Аллельное Распознавание /
Allelic
Discrimination

Allelic
Discrimination (Аллельное
Распознавание):
Открывает окно раздела меню анализа,
предназначенного для аллельного
распознавания. Для этого анализа
исполь-зуются кинетические данные по
двум или более каналов.

Для
Аллельного Распознавания не достаточно
дважды щёлкнуть по каналу, который Вы
хотели бы проанализировать, поскольку
такой анализ проводится по многим
каналам одновременно. Для проведения
такого анализа либо удерживайте клавишу
CTRL
и щелкните мышью, чтобы высветить каждый
канал, который Вам хотелось бы
проанализировать, либо протащите мышь
по этим каналам. Как только желаемые
каналы высветились, щёлкните по кнопке
Show
(Показать).
Список
обновится, показывая все выбранные
каналы на одной линии с пометкой
(галочкой), стоящей рядом с ними. Это
показывает, что все они используются в
одном анализе. Вы можете «разделить»
эти каналы щелчком правой кнопки мыши
на анализе и выбором опции Remove
Analysis
(Удалить
Анализ).
Тогда
Вы сможете включить эти каналы в другой
анализ Аллельного Распознавания.
Пожалуйста, обратите внимание, что один
канал может быть использован однократно
в каждом типе анализа.

Анализ
Аллельного Распознавания позволяет
проводить генотипирование, используя
зонды с двойной меткой. Генотипы образцов
выводятся на экран в таблице результатов.

Панель
инструментов – находится
в основном окне данного анализа вверху
и включает следующие опции:

Reports
(Отчёты):
Открывает
для предварительного просмотра Отчет
об Аллельном Распознавании.

Results
(Результаты):
Выводит
на экран таблицу результатов
генотипирования. Эта таблица открывается
с установками по умолчанию, когда анализ
впервые выводится на экран.

О
пции
нормализации: Dynamic
Tube (Динамический фон пробирки), Slope
Correct (Коррекция наклона), и
Ignore First x (Пренебречь первым): Эти
опции объяснены в главе «Количественный
анализ».

Discrimination
Threshold (Порог Распознавания):
Введите
значения в указанные текстовые ячейки,
чтобы обозначить порог распознавания
(Дискриминации). Все кривые, превышающие
эту линию порога, будут считаться
положительными по данному каналу, т.е.
содержащими соответствующую ему
ДНК-мишень. Нажмите на кнопку справа от
каждой текстовой ячейки, затем перетащите
порог на графике, чтобы установить эти
значения графически.

G

Картинка с сайта: textarchive.ru

enotypes
(Генотипы):
Открывает
окно таблицы генотипов для установления
соответствия между генотипом и каналом
(каналами) по которому регистрируется
сигнал об амплификации при данном
генотипе. На основании этого проводится
анализ Аллельного Распознавания.

В
приведённом выше примере образец
гетерозиготен, если кривые нормализованной
флуоресценции этого образца по каналам
Cycling
A.Green
и Cycling
A.Yellow
пересекают заданный порог.

Шаблон
Анализа
данных
Allelic
Discrimination

Пользователь
может сохранить настройки нормализации
кривых, выбранного уровня порога и
настроек генотипов для анализа,
экспортированные с помощью кнопки
Export

в
файл с расширением .ALT.
Этот файл можно импортировать кнопкой
Import

и
использовать для приложения такого же
анализа данных в других файлах анализа.

8.5 Анализ кривых плавления / Melt
Curve Analysis

Melt
Curve analysis
(Анализ
кривой плавления)
анализирует производные первичных
данных по кривым плавления после
сглаживания. Вы можете использовать
этот раздел меню анализа данных, вызвав
его с помощью кнопки Melt
(Плавление) в
меню Analysis,
для проведения генотипирования, или
дискриминации аллелей, а также других
приложений. Пики на кривой можно
объединять в бин-группы.
Все пики, которые ниже порогового уровня,
выбраковываются и не учитываются. Затем
Вы можете картировать пики в бинах по
отношению к генотипу, используя опцию
Genotype
(Генотип)
в меню.

При
проведении такого анализа в профиле
термоциклирования (обычно после окончания
ПЦР-амплификации) добавляют операцию
Melt
(Плавление),
чтобы визуализировать характеристики
температур плавления продуктов реакции.
При этом температура образцов повышается
линейным образом и регистрируется
флуоресценция каждого образца. Чтобы
проанализировать данные кривых плавления
нужно выбрать в меню Analysis
(Анализ)
кнопку Melt
(Плавление) и
затем нажать кнопку Show
(Показать)
(выбрав анализируемый канал в открывшемся
списке). При этом откроется графическое
окно, в котором будут представлены
дифференциальные кривые плавления –
то есть графики производной исходной
кривой плавления по температуре (dF/dT).

Ниже
представлен анализ типичной кривой
плавления, полученный при амплифи-кации
с Sybr-Green
I.

Flip
sign of dF/dT
(Перевернуть
знак dF/dT):
Прежде чем приступить к определению
величины пиков убедитесь, что знак dF/dT
выбран верно, чтобы давать положительные
пики.

Bins
(Бины – пиковые области),
используются для определения общей
области, в которой ожидается возник-новение
пиков. Программа анализа плавления
собирает пики в пиковые бин-группы,
исходя из фактических величин пиков на
кривой.

Defining
Peaks (Определение пиков):
На
экране Анализа кривой плавления пики
могут быть определены и описаны различными
методами. Одним из них является
автоматический вызов всех пиков для
каждого образца. Другой способ состоит
в заключении пиков в бины, что удобно
использовать при генотипировании
образцов.

Любой
пик, находящийся в заданном диапазоне
от центра бина, будет приписан к этому
бину. Если два пиковых бина расположены
близко друг к другу, то пик будет приписан
к ближайшему бину.

Примечание:
Группы
пиков (бины) не должны использоваться
для оценки расположения пиков. Для этих
целей используйте таблицу автоматического
вызова пиков.

Peak
Bins
(Пиковые
Бины):
Чтобы определить пиковый бин (группу
пиков), щёлкните по кнопке New
Bin
(Новый
Бин),
затем щёлкните и удерживайте щелчок на
графике, чтобы определить центр пикового
бина. Чтобы добавить другой бин, повторите
процесс или используйте кнопку Remove
(Удалить)
для удаления пиковых бинов.

Threshold
Level
(Пороговый
уровень):
Чтобы установить порог, щелкните по
иконке (решетка с красной стрелкой) в
строке Threshold,
затем щёлкните и удерживайте щелчок на
графике и протащить пороговую линию до
желаемого уровня. Можно также задать
уровень порога введя численное значение
в окошке рядом со значком решетки с
красной стрелкой. При этом пики ниже
порогового уровня учитываться не будут.

Temperature
Threshold
(Температурный
Порог):
Чтобы установить порог по температуре,
щелкните по иконке (решетка с красной
стрелкой) в строке Temperature
Threshold,
затем щёлкните и удерживайте щелчок на
графике и протащите пороговую линию
вправо. Это применяет пороговую линию
для более высоких температур (пики с
более низкими температурами не
учитываются)

Примечание:
Это
полезно, когда существуют случайные
флуктуации сигнала (помехи) при низких
температурах.

Элементы
панели инструментов

Reports
(Отчёты):
Открывает окно для выбора Отчёта о
плавлении, где можно выбрать отчёт для
предварительного просмотра. Можно
создать отчёт на основе избранного для
текущей работы канала, или создать отчет
о Многоканальном генотипировании.

Results
(Результаты):
Выводит на экран таблицу результатов,
показывая пики в образцах.

Genotypes
(Генотипы):
Открывает окно конфигурации генотипов,
где вы можете определить соответствие
между пиками и специфическими генотипами
(смотри ниже).

Этот
экран дает Вам возможность определить
генотипы по тем бинам, в которых находятся
пики кривой плавления. Конфигурация
генотипов, заданная по умолчанию,
показана на экране. При этом гетерозиготные
образцы имеют два пика, гомозиготные
образцы дают один пик в первом бине A,
а образцы дикого типа – во втором бине
B.
Рядом с названием каждого генотипа
находится поле для вписывания сокращения.
Оно используется при распечатывании
отчетов многоканального генотипирования
таким образом, чтобы все результаты,
полученные на многих каналах, легко
читались на экране.

Для
проведения мультиплексного анализа
генотипы должны быть установ-лены в
каждом канале отдельно. Если, например,
проводится двухканальный FRET-анализ, в
котором дикий тип, гетерозиготный и
гомозиготный генотипы ожидаются в
каждом канале, то вышеуказанная установка
должна быть приме-нена к каждому каналу.
Тогда результаты будут отражены в
комплексном отчёте.

Шаблон
Анализа данных кривых плавления Melt

Пользователь
может сохранить настройки нормализации
кривых, пороги, настройки генотипов и
бинов для анализа, экспортированные с
помощью кнопки Export
в файл с расширением .MET.
Этот файл можно импортировать кнопкой
Import
и использовать для приложения такого
же анализа данных в других файлах анализа
кривых плавления.

1. High Resolution Melt Analysis
   

Анализ кривых Плавления Высокого
Разрешения

Кривые
плавления с высоким разрешением – HRM
(High
Resolution
Melt)

Этот
анализ позволяет характеризовать
образцы ДНК-мишени по длине и GC-составу,
и более детально характеризовать
последовательность ДНК-мишени по ее
комплементарности зонду. Генотипирование
по полиморфизму единичных нуклеотидов
(SNP)
– типичное применение данного анализа,
при этом его использование позволяет
снизить себестоимость такого теста по
сравнению с другими применяемыми для
этого методами.

Использовать
опцию HRM—анализа
могут пользователи, работающие с прибором
Rotor-Gene
6000 определенной конфигурации,
предоставляющим эту опцию.

Чтобы
выполнить такой анализ данных выберите
в меню Analysis
кнопку
Hi—Res
Melt.
Дважды щелкните по значку канала,
используемого для анализа. Исходные
кривые плавления будут нормализованы
путем усреднения их начального и
конечного уровней флуоресценции с
последующим приравниванием начальной
и конечной точки кривой для каждого из
образцов соответствующему среднему.

Для
автоматического определения генотипа
образцов выберите кнопку Genotypes
в

меню
основного окна (над графиками). Введите
имя генотипа и номер образца, который
используется в качестве положительного
контроля для данного генотипа. После
определения положительных контролей
генотипов программа автоматически
определит генотипы тестируемых образцов
(генотип которых неизвестен) по форме
кривой образца. Для каждого образца
также рассчитывается величина параметра
R,
характеризующего достоверность
результата.

8.7 Scatter
Analysis
/ Анализ Распределения

Анализ
распределения позволяет генотипировать
образцы на основании сравнения кривых
амплификации, детектируемых на двух
различных каналах. Результаты будут
представлены в одном окне, где Вы можете
визуально сравнивать результаты по
обоим каналам для каждого образца. В
отличие от анализа Аллельной Дискриминации,
определение генотипа здесь основано
на том, в какой области находится точка,
отображающая данный образец на диаграмме
распределения.

Для
анализа распределения не достаточно
дважды щёлкнуть по каналу, который Вы
хотели бы проанализировать, поскольку
такой анализ проводится по нескольким
каналам одновременно.

Для
проведения такого анализа либо удерживайте
клавишу SHIFT и щелкните мышью, чтобы
высветить каждый канал, который Вам
хотелось бы проанализировать, либо
протащите мышь по этим каналам. Как
только желаемые каналы высветились,
щёлкните по кнопке Show
(Показать).
Список пополнится и будет показывать
все выбранные каналы на одной линии с
пометкой (галочкой),
стоящей рядом с ними. Это показывает,
что все они используются в одном анализе.
Вы можете «разделить» эти каналы щелчком
правой кнопки мыши на анализе и выбором
опции Remove
Analysis
(Удалить
Анализ).
Тогда Вы сможете включить эти каналы в
другой Анализ Распределения. Обратите
внимание, что один канал может быть
использован однократно в каждом типе
анализа.

Панель
инструментов:

Reports
(Отчёты):
Открывает
для предварительного просмотра Отчет
об Аллельном Распознавании.

Results
(Результаты):
Выводит
на экран таблицу результатов
генотипирования. Генотип каждого образца
определяется в соответствии с определенными
пользователем областями на диаграмме
распределения. Когда анализ впервые
выводится на экран, эта таблица открывается
с установками по умолчанию.

Опции
нормализации:
Dynamic
Tube (Динамический
фон пробирки),
Slope Correct (Коррекция
наклона),
и
Ignore First x (Пренебречь
первыми х циклами):
Эти
опции подробно объяснены в главе
«Количественный анализ».

G

Картинка с сайта: textarchive.ru

enotypes
(Генотипы):
Открывает
окно таблицы генотипов, в которой
определяют, какой генотип определяется
по каждому из каналов.

Это
окно позволяет Вам задать соответствие
генотипа и канала, по которому
регистрируется амплификация для анализа
распределения. Определение генотипов
здесь сделает доступной опцию для
определения генотипов на диаграмме
распределения. Обратите внимание, что
результаты будут анализироваться на
основе генотипов, заданных пользователем
в окне Scatter
Graph (Диаграмма Распределения).
В таблице, представленной выше, определены
генотипы по умолчанию, которые
используются для графического
представления и будут выведены в
соответствующих углах графика
распределения.

Scatter
Graph (Диаграмма
Распределения):
На
Диаграмме
Распределения представлены данные по
обоим каналам в виде точек, соответствующих
образцам, координаты которых по
соответствующим осям отражают сигнал
об амплификации, регистрируемый по
соответствующему каналу. Пользователь
может изменять границы областей на
графике, которые отвечают различным
генотипам Wildtype,
Heterozygouse, Mutant
(Дикий
тип, Гетерозиготный и Мутантный тип).
Для этого нужно кликнуть по нужной
области и протащить мышь для выделения
желаемой области. В окне диаграммы
распределения пространство нормализовано
с учетом различной степени нарастания
сигнала по каждому из каналов и переведено
в логарифмический масштаб, чтобы усилить
различия между образцами разных
генотипов.

Шаблон
Анализа данных Scatter
Analysis

Пользователь
может сохранить настройки генотипов и
границы областей на графике распределения,
экспортированные с помощью кнопки
Export
в файл с расширением .SCT.
Этот файл можно импортировать кнопкой
Import
и использовать для приложения такого
же анализа данных в других файлах анализа
кривых плавления.

8.8 Анализ по Конечной Точке /
EndPoint
Analysis

Анализ
по Конечной Точке
– метод, который позволяет детектировать
результаты амплификации, проведенной
на любом другом термоциклере (обычном
термоциклере без системы детекции)
путем измерения уровня флуоресцентного
сигнала, обусловленного накоплением
продукта ПЦР. Это – качественный анализ
(т.е. результат либо положительный. либо
отрицательный).

Ниже
описано меню EndPoint
Analysis
(Анализ
по Конечной Точке), имеющееся на данный
момент в программе Rotor-Gene
6000 v.1.7.
Стоит отметить, что следующие версии
программы будут дополнены еще одним
вариантом Анализа по Конечной Точке.
В него включены несколько дополнительных
опций и изменений, которые сделают
данный вид анализа максимально гибким
и удобным для широкого круга пользователей.
Принцип анализа результатов в новом
дополнительном меню EndPoint
Analysis
аналогичен описанному ниже. А именно,
образец определяется как положительный,
если его нормированный флуоресцентный
сигнал по соответствующему каналу
превышает пороговый уровень.

Ниже
показано основное окно, открывающееся
при использовании функции EndPoint
Analysis
(Анализ по Конечной Точке)
программы RotorGene.

Функция
EndPoint
Analysis
сходна с функцией Allelic
Discrimination
(Аллельной Дискриминации),
поскольку также предоставляет результат
анализа в форме «Reaction
/ No
Reaction»
(«реакция/нет реакции»),
и можно присваивать имена различным
комбинациям результатов реакции по
разным каналам. Анализ по Конечной Точке
отличается тем, что измерение флуоресценции
проводится только один раз, а не из цикла
в цикл для каждого образца. Поэтому для
выполнения анализа данных пользователю
нужно задать дополнительную информацию
– определить положительные
контрольные образцы
(один или несколько), для которых задают
тип
Positive
Control
в
таблице образцов, и отрицательные
контрольные образцы,
для которых обозначают тип Negative
Сontrol.

Чтобы
упростить представление данных, уровень
сигнала каждого образца нормали-зуется
относительно уровней сигнала от заданных
положительных и отрицательных контрольных
образцов по каждому каналу. Пользователь
устанавливает уровень порога сигнала,
по отношению к которому образцы
распределяются на положительные и
отрицательные.

Термины,
используемые при Анализе по Конечной
Точке

Positive
Control
(Положительный контроль)
– Образец, о котором заранее известно,
что в нем должна происходить реакция и
который представляет уровень сигнала,
равный 100%

Negative
Control
(Отрицательный контроль)
– Образец, о котором заранее
известно,
что в нем не происходит реакция. Он
представляет уровень сигнала 0%.

Threshold
(Порог)
– Уровень сигнала в процентах, при
превышении которого образец считают
положительным (прореагировавшим).
Значение этого параметра пользователю
следует задавать при каждом анализе
данных.

Signal
level
% (Уровень сигнала в %) –
Величина относительной флуоресценции

в
процентах, выраженная относительно
разности максимальной флуоресценции
положительного контроля и минимальной
флуоресценции отрицательного контроля.

Genotype
(Генотип)
– Интерпретация различных вариантов
результатов реакции по различным
каналам. Например, можно определить как
Heterozygous
(Гетерозиготные)
образцы, для которых по обоим каналам
(например, Green

и
Yellow)
получен положи-тельный результат
реакции. Функцию Genotype
(Генотип)
можно также использовать для того, чтобы
ввести обозначения для регистрации
результатов ПЦР-анализа
с учетом использования внутреннего
контроля. Например, можно обозначить
результаты как «Положительный»,
«Отрицательный» и
«Ингибирование»
в соответствии с результатами, полученными
по соответствующим каналам.

Конфигурация
профиля для EndPoint
анализа

Для
проведения анализа EndPoint
Analysis
(Анализ по Конечной Точке)
следует провести амплификацию образцов
на другом термоциклере в соответствии
с требуемым для данной реакции режимом
термоциклирования.

По
окончании реакции перенесите пробирки
в Rotor—Gene
и проведите профиль состоящий из стадии
Hold

при температуре 60°С
в течение нескольких минут, а затем
цикла из одного шага – 60°С
в течение 20
секунд с измерением флуоресценции на
соответствующих каналах, с повторением
этого цикла пять раз. Профиль представлен
на примере ниже:

Это
примерный профиль, предлагаемый для
проведения анализа EndPoint.
Можно варьировать, например, температуру
или время ступени в зависимости от
особенностей данного конкретного
анализа.

Чем
больше число повторов цикла, тем больше
информации для анализа. При этом
автоматически проводится усреднение
всех данных, полученных для каждого
образца, и анализируется полученное
среднее значение. В обычном случае (если
не требуется очень высокий уровень
точности измерений) вполне достаточно
пяти повторов цикла для получения
данных.

Анализ
данных

Вы
можете проводить анализ EndPoint
по
нескольким каналам одновременно.

Для
выполнения этого вида анализа данных
выберите в меню Analysis
(Анализ),

в
появившемся окне выберите кнопку
EndPoint,
в списке каналов в этом же окне выделите
с помощью мыши требуемые каналы и нажмите
кнопку Show
(Показать).
Появится окно анализа Analysis.

Определение
контролей

Если
Положительный и Отрицательный контроли
заранее не были заданы в таблице образцов,
то когда Вы выберете в меню выполнение
анализа EndPoint
для этих данных, то появится следующее
сообщение: «Чтобы
использовать анализ EndPoint
нужно иметь положительный и отрицательный
контроли для каждого канала. Чтобы
определить контроли, кликните OK».

После
того как Вы щелкните мышью по кнопке
OK,
откроется окно, позволяющее определить
образцы, представляющие Positive
Сontrol
(Положительный контроль)

и
Negative
Сontrol
(Отрицательный контроль).
Это окно аналогично окну редак-тирования
образцов. Если образец является
положительным контролем хотя бы по
одному каналу, определите его тип в
таблице образцов как Positive
Сontrol
(Положительный контроль).
Аналогично для отрицательных контролей
(хотя бы по одному каналу) задайте тип
Negative
Сontrol
(Отрицательный контроль).
Остальные образцы следует определить
как Unknown.

Нормализация

Нормализация
данных анализа EndPoint
приводит
данные для всех образцов по всем
анализируемым каналам в диапазон от 0
до 100.
При этом необходимо задать минимум по
одному образцу, представляющих Positive
Сontrol
и
Negative
Сontrol,
однако потребуется больше контролей,
если Вы проводите анализ по нескольким
каналам, а используемые контрольные
образцы – не мультиплексные (т.е.содержат
одну ДНК-мишень, детектируемую по одному
каналу). Следует также использовать
несколько контролей каждого типа, если
существует риск, что положительный
контроль может не амплифицироваться.

Для
каждого канала из всех образцов,
определенных как положительные контроли,
будет выбран один с максимальным уровнем
флуоресценции и его флуоресценция будет
принят за 100%.
Таким образом, если задано два или
несколько положительных контролей, то
даже если один из них не прореагирует,
полученные при проведении анализа
данные можно будет интерпретировать.

Из
всех отрицательных образцов будет
выбран один с самым низким уровнем
флуоресценции и этот уровень принимается
за 0%.

Необработанные
данные измерений флуоресценции для
остальных образцов масштабируются
(нормализуются) относительно наибольшего
положительного контроля и наименьшего
отрицательного контроля.

Пример:

Образец	Тип	Флуоресценция
1	Positive Control	56.3
2	Positive Control	53.0
3	Negative Control	4.5
4	Negative Control	4.3
5	Unknown	48.1
6	Unknown	6.4

В
данном примере получены удачные данные,
для двух положительных контрольных
образцов получены близкие значения,
аналогично для двух отрицательных
контрольных образцов, а значения,
полученные для исследуемых образцов 5
и 6,
находятся в диа-пазоне между значениями,
полученными для положительных
и отрицательных
контролей.

Далее
приведены значения нормализованного
сигнала

Образец	Тип	Сигнал %
1	Positive Control	100.0
2	Positive Control	93.7
3	Negative Control	0.4
4	Negative Control	0.0
5	Unknown	84.2
6	Unknown	4.0

Образец
1
определен как положительный
контроль
и величина флуоресцентного сигнала,
полученного для него, имеет наибольшее
значение, поэтому его уровень сигнала
принят за 100%. Образец 4 – отрицательный
контроль,
для которого получен наименьший уровень
флуоресцентного сигнала, определяет
уровень сигнала 0%. Очевидно, что образец
5, дал положительный результат реакции,
а образец 6,

по-видимому,
отрицательный.

Если
вы получаете сообщение, что сигнал
образца Negative
Сontrol
выше, чем образца Positive
Control,
значит,
образцы были обозначены неправильно.
Поскольку такие результаты нельзя
логически интерпретировать, то программа
выдаст следующее предупреждение: «График
не может быть построен, так как
отрицательные контроли находятся на
том же уровне или выше, чем положительные
контроли».

Нормализация
при анализе по нескольким каналам

Если
Вы анализируете данные по нескольким
каналам, то, тем не менее, отрицательные
и положительные
контроли
задаются в одной таблице.

Если
образец является положительным контролем
хотя бы по одному каналу, определите
его тип как Positive
Сontrol
(Положительный контроль).
Аналогично для отрицательных контролей
(хотя бы по одному каналу) задайте тип
Negative
Сontrol
(Отрицательный контроль).

Таким
образом, если образец является
положительным контролем по каналу
Green,
но не является контролем по каналу
Yellow,
его следует определить как положительный
контроль.
Поскольку другой положительный контроль
по каналу Yellow
будет
давать положительный результат реакции,
образец, являющийся контролем по каналу
Green

будет проигнорирован (не будет
использоваться как положительный
контроль по каналу Yellow).
Единственное ограничение здесь состоит
в том, что один образец не может
одновременно являться положительным
контролем по одному каналу и отрицательным
контролем по другому.

Threshold
(Порог):
используется
для того, чтобы определить уровень
сигнала в процентах, необходимый, чтобы
считать образец прореагировавшим по
каждому каналу. Когда заданы положительный
и отрицательный контроли, все данные
по сигналам образцов по всем каналам
будут нормализованы в одном масштабе
от 0
до 100%,
поэтому для анализа достаточно определить
один уровень порога и в том случае, если
анализ проводится по нескольким каналам.

Щелкните
кнопкой мыши на линии порога и передвиньте
ее на нужный уровень в области между 0
и 100
%.
Уровень порога не должен быть слишком
близко к точкам, полученным для образцов
с обеих сторон от него (если точки
образцов находятся близко к порогу, это
признак того, что данные нельзя
интерпретировать с уверенностью). Если
разность между реагирующим и не
реагирующим образцом составляет всего
2-3%,
то один и тот же образец при повторном
анализе может оказаться как с одной,
так и с другой стороны линии порога, то
есть давать как положительный, так и
отрицательный результат.

Genotypes
(Генотипы)

Как
и в меню Аллельной дискриминации, данная
опция открывает окно, в котором можно
задать какой генотип определяется на
каждом из каналов.

В
приведенном выше примере генотип образца
Heterozygous
(Гетерозиготный),
в случае, если относительные значения,
полученные для этого образца, превышают
порог как по каналу Cycling
A.Green,
так и по каналу Cycling
A.Yellow.

Функцию
Genotype
(Генотип)
можно также использовать для того, чтобы
ввести обозначения для регистрации
результатов ПЦР-анализа
с учетом использования внутреннего
контроля. Например, можно обозначить
результаты как «Положительный»,
«Отрицательный» и
«Ингибирование»
в соответствии с результатами, полученными
по соответствующим каналам.

Шаблон
Анализа данных EndPoint

Пользователь
может сохранить настройки генотипа и
выбранный уровень порога для анализа,
экспортированные с помощью кнопки
Export
в файл с расширением .ENT.
Этот файл можно импортировать кнопкой
Import
и использовать для приложения такого
же анализа данных в других файлах Анализа
по Конечной Точке.

8.9 Метод Относительного
Количественного Анализа Дельта-дельта
Ct
/
/ Delta
delta
Ct
Relative
Quantitation

Метод
сравнительного анализа Ct
является методом, применяемым для
анализа Относительной Экспрессии генов.
Этот
метод
описан
в
следующих
публикациях:
«Analysis
of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and
the 2^[ -delta
delta C(T) ] Method.» Livak KJ & Schmittgen TD. Methods 2001
Dec;25(4): 402-408

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=pubmed&dopt=Abstract&list_uids=11846609

Этот
метод не требует построения кривой
стандартов в каждом анализе. Результат
каждого образца сначала нормализуется
по количеству ДНК-мишени в образце
относительно количества Гена Нормализации
(гена «домашнего хозяйства»), представляющего
собой эндогенный внутренний контроль.
Это нормализованное значение далее
нормализуется по калибратору. Калибратором
может быть, например, образец дикого
типа, не подвергавшийся воздействиям
контрольный образец или образец, взятый
в нулевой момент времени.

Важно
при применении этого метода, чтобы
эффективность реакции амплификации
для Гена-Мишени и для Гена Нормализации
были одинаковыми, это нужно проверить
согласно рекомендациям, приведенным в
указанной выше статье.

Важно
правильно определить образцы в Редакторе
таблицы Образцов, чтобы один и тот же
образец был обозначен одинаково во всех
частях таблицы.

Последовательность
действий для выполнения такого анализа
описана ниже.

Проанализируйте
данные, используя меню Количественного
анализа Quantitation.
При этом не требуется построения кривой
стандартов, поскольку данный метод
оперирует только значениями Ct.

В
меню анализа выберите кнопку Other
и
в появившемся списке выберите
Delta Delta

CT Relative Quantitation,
затем New
Analysis.

1. Введите
   название для анализа

1. В
   открывшемся окне Relative
   Quantitation
   нужно отметить галочкой бокс в строке
   Validation
   Run Performed,
   чтобы можно было применить данный вид
   анализа (это означает, что Вы проверили
   корректность применения этого варианта
   анализа для данных Вашего теста в
   соответствии с рекомендациями в статье,
   указанной выше). Затем требуется
   обозначить по какому каналу (и с какой
   страницей таблицы образцов) анализируется
   Ген-Мишень (Gene
   of
   Interest)
   и Ген Нормализации (Normaliser).
   Для этого, щелкнув кнопкой мыши, поставьте
   галочку в строке Gene
   of
   Interest
   Quantitation,
   и
   в появившемся окне выберите нужный
   вариант, соответствующий каналу и
   странице в таблице образцов для
   Гена-Мишени, и нажмите кнопку Select.
   Аналогично
   выполните выбор данных для Гена
   Нормализации, поставив галочку в строке
   Normaliser
   Quantitation.
   Чтобы обозначить образец-калибратор
   пометьте галочкой бокс в строке
   Calibrator
   Defined.

1. Нажмите
   кнопку Reports,
   откроется окно браузера Reports
   Browser.
   Выберите нужный вид анализа и нажмите
   кнопку Show,
   чтобы получить отчет о результатах.
   Выбрав кнопку Export,
   Вы можете экспортировать результаты
   в лист Excel.

В
последнем окне подготовки отчета будет
представлена таблица результатов,
включающая для каждого образца значения
Ct
для Гена-Мишени (колонка GOI
CT)
и Ct
Гена Нормализации (Norm.
CT),
Delta
Ct,
Delta
Delta
Ct,
и Относительную Концентрацию
(Relative Conc.). Когда
определен образец-калибратор, то
Относительные Концентрации образцов
представлены в виде отношения к
концентрации образца-калибратора,
принятой за единицу. Результаты можно
сохранить в файл Word.

1. Сравнительный Количественный
   Анализ / Comparative
   Quantitation

Опция
меню Comparative
Quantitation
используется
для сравнения относительной экспрессии
гена в образцах с экспрессией в контрольном
образце при отсутствии кривой стандартов.
Такой подход часто используется при
анализе с помощью микрочипов.

Чтобы
выполнить такой анализ в меню анализа
выберите кнопку Other
и
в появившемся списке выберите Comparative
Quantitation,
выберите двойным щелчком канал, данные
которого требуется проанализировать.
Выберите контрольный образец в появившемся
меню Calibrator
Replicate
в правой части экрана под таблицей
образцов. В таблице под графиком будут
представлены результаты автоматического
расчета. В таблице в первой колонке
указаны названия образцов. Во второй
колонке, которая озаглавлена «Takeoff»,
для каждого образца указана точка начала
амплификации «Takeoff».
График второй производной от кривой
накопления флуоресцентного сигнала в
ходе амплификации содержит пик,
соответствующий максимальной скорости
нарастания флуоресцентного сигнала.
Точка начала амплификации «Takeoff»
определяется
как цикл, при котором величина второй
производной составляет 20% от своего
максимального значения. Эта точка
указывает на конец базального участка
с шумами и начало экспоненциальной
фазы.

На
приведенном ниже рисунке показан график
второй производной от кривой накопления
флуоресцентного сигнала в ходе реакции
и показано относительное расположение
пика и точки «Takeoff».

Третий
столбец «Amplification»
представляет эффективность реакции в
каждом образце. В результате реакции
со 100%-ой эффективностью значение
амплификации было бы равно 2 для каждого
образца, это означает, что в каждом цикле
происходит удвоение количества
ампликонов. Что касается необработанных
данных, то в логарифмической фазе сигнал
должен усиливаться в два раза за каждый
цикл. Таким образом, если сигнал во время
12 цикла был равен 50, затем во время 13
цикла он повысился до 51, он должен
возрасти до 53 флуоресцентных единиц во
время 14 цикла. Все значения амплификации
для каждого образца усредняются для
получения величины амплификации, которая
показана справа под таблицей образцов.
Чем больше колебания рассчитанных
величин эффективности амплификации в
каждом образце, тем больше будет
доверительный интервал (показан в виде
значения после символа ±).
При большом количестве (N)
анализируемых образцов доверительный
интервал указывает диапазон в который
с вероятностью 68,3% попадают значения
показателя эффективности реакции в
образцах (1 стандартное отклонение).
Удваивая ±
интервал,
получим 95,4% доверительный интервал при
большом количестве образцов N.

Образцы—калибраторы
(Calibrator Replicate)

Также
как и для метода «дельта-дельта Ct»
относительного количественного анализа
(Livak,
1991) для рассматриваемого метода
необходимо знать параметры образца
калибратора, чтобы определять остальные
образцы относительно него. Обратите
внимание, что если образец-калибратор
имеет реплики в виде нескольких образцов
с одинаковым именем, то будет рассчитываться
среднее значений параметра «Takeoff»
этих
образцов. Таким образом, чтобы
воспользоваться усредненными по
нескольким репликам параметрами
образца–калибратора, необходимо
обозначить эти реплики одним и тем же
именем.

Средняя
величина амплификации нужна, чтобы
правильно рассчитать для образца
экспрессию гена в нем. Если, например,
величина амплификации в образце ниже,
то такое же количество ампликонов с
ДНК-мишени будет наработано позже, чем
при более высоком показателе амплификации.
Основываясь на точке начала амплификации
«Takeoff»
и
показателе эффективности реакции в
образце, программа рассчитывает
относительную концентрацию в каждом
образце по сравнению с образцом-калибратором,
заданным пользователем. Концентрация
указана в формате научной записи числа.

Последовательность
действий для расчета относительной
концентрации:

1. Рассчитывают
   точки начала амплификации «Takeoff»,
   основываясь на пиках второй производной.

2. Рассчитывают
   среднее возрастание флуоресцентного
   сигнала (не обработанных данных) по 4
   точкам (циклам) непосредственно после
   точки «Takeoff»
   и
   таким образом определяют показатель
   амплификации образца.

3. Выбросы
   значений показателя амплификации
   (резко отличающиеся от остальных)
   удаляются, чтобы учесть возможность
   шумов фоновой флуоресценции.

4. Все
   значения показателя амплификации,
   кроме выбросов, усредняют, чтобы
   рассчитать среднюю эффективность
   амплификации «Average
   Amplification».

5. Для
   всех образцов, являющихся репликами
   образца-калибратора рассчитывается
   среднее показателя точки начала
   амплификации «Takeoff».

6. Относительная
   концентрация образца рассчитывается
   по формуле:

Amplification
^ (Takeoff
калибратора
– Takeoff
данного
образца)

1. Рассчитанная
   относительная концентрация представляется
   в формате научной записи.

1. Измерение
   концентрации
   ДНК
   / Concentration Analysis

Опция
Concentration
Analysis
(Mesurement)
позволяет использовать прибор и для
измерения концентрации ДНК, а также для
флуориметрических измерений.

Ниже
показано
окно
анализа
Concentration
Analysis.

Подготовка
проведения анализа

Для
проведения анализа по измерению
концентраций ДНК в образцах сначала
подготовьте свои образцы-стандарты и
тестируемые образцы, желательно в трех
повторах каждый.

Подготовка
Стандартов

Для
определения концентрации ДНК в каждом
из измеренных образцов используют
кривую стандартов. ДНК, используемая
для образцов-стандартов, должна быть
аналогичной ДНК в измеряемых образцах.
Рекомендуется измерить концентрацию
ДНК хотя бы одного образца с помощью
UV-спектрофотометра
и использовать его в качестве стандарта.
Минимальное количество образцов-стандартов,
которые нужно использовать, составляет
3 образца. Важно, что линейность зависимости
флуоресценции от концентрации сохраняется
только в диапазоне от 1 до 100 нанограмм
на микролитр. (Т.е. в этом диапазоне если
концентрация ДНК уменьшится в два раза,
то так же в два раза уменьшится
флуоресценция). Доверительный интервал
для концентраций вне этого диапазона
будет весьма широким из-за отклонения
от линейности.

Тип
измеряемой ДНК. Для разных форм ДНК
наблюдаются различия при измерении
концентрации, например, геномная ДНК
отличается по сравнению с плазмидной
ДНК. Поэтому рекомендуется измерять
вместе только образцы, содержащие
сходную ДНК. Не следует использовать
стандарты с плазмидной ДНК для измерения
геномной ДНК.

Установки
анализа.
Выберите в мастере Быстрого Старта
шаблон Nucleic
Acid
Concentration
Measurement.

Примечание.
Убедитесь, что в первой пробирке в
роторе находится положительный контроль.
Без этого положительного контроля
программа не сможет автоматически
оптимизировать установки параметра
«gain»
для получения максимальной чувстсвительности.
Подсказка об этом появится перед каждым
запуском такого анализа.

Анализ
данных.

Меню
анализа Concentration
Measurement
основывается
на зависимости флуоресценции от
концентрации. Есть два доступных
алгоритма, которые могут быть более или
менее полезными в зависимости от
используемых реагентов и задачи.

1. Линейная
   регрессия: анализируют данные, исходя
   из предположения о линейной зависимости
   и рассчитывая оценку неизвестных
   величин на базе линейной модели. При
   этом можно определить ошибку измерения
   по отклонению полученных данных от
   линейной модели и получить статистический
   анализ вариаций (ANOVA).

2. Аппроксимация
   сплайновой кривой. При этом варианте
   делается меньше допущений о зависимости
   флуоресценции от концентрации. Он
   позволяет получать более точные
   результаты для данных с нелинейностью,
   однако не позволяет статистический
   анализ вариаций (ANOVA)

9. Обзор
основных функций в Меню (продолжение)

9.1
Меню
Run (Запуск)

Start Run (Старт)

Запускает
выполнение программы анализа с
определенным Температурным
Профилем
и установками для параметра Gain
для
детекции данных. Прежде чем Rotor—Gene
начнёт работу, появляется экран
подтверждения программы анализа. На
экран выводится графическое изображение
планируемого профиля термоциклирования
и детекции и установок параметра Gain
(Усиление)
для каждого канала.

Pause Run
(Временная остановка работы прибора)

Вы
можете использовать эту кнопку, чтобы
приостановить и возобновить выполнение
программы анализа. Поскольку выполнение
этой операции может серьёзно повлиять
на результаты, через все каналы нарисован
маркёр, полученный в ходе текущего
цикла. На экране также появляется
сообщение.

ОСТОРОЖНО:
при
временной остановке (паузе) прибор не
будет охлаждаться до комнатной
температуры, необходимо подождать,
прежде, чем можно будет браться за ротор
или пробирки, находившиеся в приборе.

Stop Run (Прекращение работы прибора)

Эту
кнопку можно использовать для экстренной
остановки работы прибора. При остановке
работы прибора с помощью этой кнопки в
меню появится подсказка, которая попросит
Вас подтвердить прекращение выполнения
программы анализа.

9.2
Меню View
(Просмотр)

9.2.1 Settings (Установки
при проведении анализа)

General
(Общие):
Эта таблица позволяет просматривать
информацию о проведении данного анализа,
название файла анализа, дополнительные
сведения, имя оператора и другие
сопутствующие сведения.

Окно
информации содержит всю информацию за
исключением профиля, требуемого для
конфигурации программы выполнения
анализа. После завершения выполнения
анализа на экран выводится следующая
информация: тип и серийный номер прибора,
использованная версия программного
обеспечения, использованные для детекции
каналы и время старта/финиша.

Machine
Options (Опции
прибора):
Эта таблица содержит установки для
конфигу-рации прибора Rotor—Gene.

Rotor
Type
(Тип
ротора):
Следует установить тип ротора, в
соответствии с тем, какой ротор установлен
в текущий момент. Если открыть файл
ранее проведенного анализа, то он будет
содержать сведения о том роторе, который
был задан для использования в момент
выполнения анализа.

Messages
(Сообщения):
Это окно выводит на экран сообщения,
если оператор изменял программу анализа
в процессе ее выполнения, т.е. применял
такие действия, как приостановка работы
прибора или пропуск циклов во время
термоциклирования. Она также показывает
предупреждения, полученные в ходе
выполнения анализа. Следует проверить
эту таблицу, если Вы получили необычные
результаты.

Channels
(Каналы):
При создании конфигурации новой программы
анализа эта таблица каналов выводит на
экран текущую конфигурацию каналов,
доступную для использования в приборе.
Если Вы просматриваете файл уже
выполненного анализа, то это окно
отражает информацию о конфигурации
каналов во время его проведения.

С
помощью этого окна при запуске анализа
Вы можете изменять параметр Gain
(Усиление)
и создать или модифицировать каналы.
Чтобы восстановить установки каналов
по умолчанию в случае, если новые
установки не подходят, щелкните по
кнопке Reset
Defaults
(Установки
по умолчанию).

Описание
содержания окна таблицы каналов
(Channels)

Name
(Имя):
Описывает названия каналов.

Source
(Источник):
Определяет
длину волны источника энергии (светодиода).

Detector
(Детектор):
Указывает
длину волны фильтра детекции.

Gain
(Усиление):
Устанавливает
значение параметра усиления gain
для отдельного канала.

Create
new (Создать
новый):
Эта
опция в панели кнопок справа позволяет
создавать новые каналы. При нажатии на
данную кнопку открывается окно, которое
запрашивает информацию о новом названии,
источнике и фильтре детекции. Фильтр
можно выбрать, используя ниспадающее
меню рядом с каждым окном.

Вариант
эффективной конфигурации каналов:

Канал

Источник/Детектор Примеры
Флуорофоров
Green 470nm/510nm FAM,
Sybr
Green
I

Yellow 530nm/555nm JOE,
VIC, TET

Orange 585nm/610nm ROX,
Tamra

Red 625nm/665nm Cy5,
LC 640

User
defined 470nm/665nm FRET с
Cy5, LC640 и
др.

Каналы
Green,
Yellow,
Orange
и
Red
имеют
стандартную конфигурацию для 4-кана-льной
мультиплексной детекции. Необходимо
использовать молекулы гашения на 3´конце
зондов с двойной меткой, с тем, чтобы не
занимать ширину спектральных полос
пропускания. Наилучшей комбинацией
являются BHQ
(black hole quencher
– гаситель лаборатории Biosearch Technologies):
Green/BHQ1,
Yellow
/BHQ1, Orange/BHQ2,
Red/BHQ3.

Канал
470nm/665nm
применяется
для детекции, например, Cy5
или LC640
в реакции FRET,
когда определяется прирост энергии. Он
может применяться для количественного
анализа или детекции мутаций.

ПРИМЕЧАНИЕ.
Для
детекции мутаций при работе с FRET-зондами
информация содержится в изменении
кривой плавления и не имеет значения,
определяется ли подъём в Cy5
или спад в FAM.
Это полезно при мультиплексном анализе
для детекции мутации, поскольку комбинации
FAM/BHQ1
и JOE/BHQ1
могут применяться с детекцией по Green
и Yellow
каналам, соответственно.

Tube
Layout
(Схема
Пробирок):
Если Вы используете 72-луночный
ротор, возможно Вы захотите реорганизовать
таблицу образцов для более точного
соответствия со схемой, которую Вы
применяете в блоках (штативах) 9х8.
Опции схемы пробирок позволяют Вам
метить образцы последовательно (по
умолчанию), так что они будут перечислены
по порядку их расположения в роторе,
или помечать каждые 9
образцов (1А,
1В, 1С
и т.д.) Это полезно при использовании
многоканальной пипетки для внесения
образцов. При изменении этой установки
Вам следует проделать пробный тест,
чтобы убедиться, что конфигурация,
которую Вы избрали для данной опции,
работает правильно, так, как Вам хотелось
бы.

Security
(Безопасность
информации). Это
окно содержит информацию о Подписи
(коде) файла анализа. Подпись – это не
отменяемый ключ, который обновляется
каждый раз, когда файл с данными анализа
был изменен. Если какая-либо часть файла
*.Rex
была
изменена вне программы, подпись и файл
перестанут соответствовать друг другу.
Используя подпись, вы можете убедиться,
что первичные (необработанные) данные
анализа никто не изменял вне программы,
что файл не был подделан и температурный
график достоверен. Подпись предохраняет
также от непредумышленных ошибок, таких
как ошибки файловой системы.

В
случае, если подпись была нарушена
(одним из перечисленных способов), при
обращении к этому файлу появится
предупреждение: There
is no signature (Нет подписи).

9.2.2
Temperature Graph (График
температуры)

Т

емпературный
график показывает, как менялась
температура в камере во время выполнения
программы анализа. Для каждого шага
программы показаны Set
(Установка),
Actual
temp (Фактическая температура)
и Hold
time (Время удерживания).

При
загрузке файла уже существующего анализа
температурный график показывает
изменение температуры в ходе его
выполнения. Вертикальная шкала имеет
диапазон

20-100ºС,
горизонтальная шкала отражает время в
минутах. Используйте панель прокрутки
для перемещения вперед и назад по графику
изменения температуры.

9.2.3 Profile Progress
(Выполнение Профиля)

Этот
экран показывает графическое изображение
профиля термоциклирования, выполняемого
в данном анализе. После старта, когда
прибор начал выполнять программу в
затенённой части экрана показывается
число циклов, которые уже были завершены.
Сверху указано время в минутах, которое
необходимо для завершения программы.

В

низу
имеются 2 кнопки: Skip
(Пропустить)
и Add
5 Cycles.
Кнопка Skip
позволяет перескочить через любой шаг
профиля, кнопка Add
5 Cycles (Добавить 5 циклов)
дает возможность добавить 5
циклов
к циклическому профилю.

9.2.4 Редактор образцов
/ Samples

Это
окно функционально идентично редактору
таблицы образцов в Мастере Старта.
Доступ к этому меню можно получить,
выбрав в основной панели инструментов
Samples,
или
щелкнув
кнопку Edit
samples
под цветной таблицей образцов справа
(или после щелчка правой кнопкой мыши
по этой цветной таблице образцов). В
данном окне Вы вводите данные всех
анализируемых образцов: положение
пробирки в роторе, название и тип
образца, а также задаете цвет, которым
будут обозначены графики данных для
данного образца. Подробно эти действия
описаны в разделе 6.5
Редактирование таблицы образцов.

1. Опции
   Экрана
   / Display options

S

Картинка с сайта: textarchive.ru

how
at most 2 (6) analysis windows
(Показывать
не более двух (6) окон анализа):
Будучи включенной, эта опция показывает
одновременно 2 (6) окон анализа.

При
проведении количественного анализа по
умолчанию открываются три окна. Если
одновременно открыты более шести или
семи окон, то общее обозрение может быть
не чётким. Будучи включенной, эта опция
2 окон закрывает первое окно анализа и
замещает его последним открытым окном
анализа. Если эта опция выключена, то
на экран могут одновременно выводиться
три и более окна. Это может быть полезно
при сравнении данных четырех различных
каналов.

9.3
Меню Window
(Окно)

Это
меню позволяет Вам расположить окна
вертикально, горизонтально или
организовать окна в каскад. Следующая
опция для организации расположения
окон находится в разделе Arrange
(Организовать)
в меню панели инструментов.

9.4
Меню Help
(Помощь)

Содержание
включает все файлы помощи, рассортированные
по названиям. Просто войдите в оглавление
и выберите интересующую вас область.
Опция What‘
new?
(Что нового?)
даёт краткий обзор новых характеристик,
дополненных по сравнению с предыдущими
выпусками программы.

Помощь
в Контексте откроет файл помощи в
соответствии с активированным окном
программы Rotor—Gene.
Нажатие Corbett
Research Website
автоматически откроет Веб-страницу
изготовителя прибора, в то время как
форум можно посетить, нажав Forum
Rotor-Gene on-line (Форум по Rotor—Gene)
.
Раздел About
Rotor-Gene
разъясняет Вам некоторые подробности,
например, серийный номер прибора или
версию программного обеспечения, которой
Вы пользуетесь.

Примечание.
Доступ
на сайт изготовителя возможен только
при подключении данного компьютера к
сети Internet.

1. Меню
   Security
   (Безопасность информации)

Программа
Rotor-Gene содержит функциональные возможности,
которые обеспечивают безопасность
информации при работе в диагностической
лаборатории. Когда программа правильно
настроена, она может гарантировать
следующее:

1. •
   Доступ
   к прибору Rotor-Gene 6000 или к программному
   обеспечению для анализа данных ограничен
   рамками групп пользователей.

2. •
   Изменения
   в файле данных анализа заблокированы

3. •
   Несанкционированные
   изменения фиксируются с помощью функции
   подписи

4. •
   Шаблоны,
   используемые для выполнения анализа,
   заблокированы

Объединение
с защитой Windows

Чтобы
поддерживать высокий уровень
ответственности, программа Rotor-Gene
управляет защитой информации не
внутренне, а используя встроенную защиту
Windows (Windows NT Security). Таким образом
организовано управление для всех учетные
записей пользователей, групп и паролей.
Такая интеграция позволяет использовать
один пароль для доступа к компьютерной
сети и для управления доступом в программе
Rotor-Gene, что означает более удобное
администрирование. В больших организациях
администраторы сети могут легко отменить
доступ к сети для пользователей, которые
уходят из компании, с помощью
централизованной модели защиты
информации.

На
основании этого установка защиты
программы Rotor-Gene главным образом включает
в себя конфигурацию защиты Windows в
соответствии с наилучшей практикой.

Предварительные
условия

Для
использования защиты вы должны
использовать Windows NT4 Service Pack 6, Windows 2000 или
Windows XP Professional. Возможности защиты не
могут быть использованы с Windows XP Home, так
как эта операционная система не имеет
соответствующей модели доступа,
используемой программой. Необходимо
также при установке программы активировать
опцию «Force
Authentication through Windows NT Logon».

ЗАМЕЧАНИЕ:
Меню Защиты не появится, если вы
зарегистрированы на Linux Samba домене. Чтобы
использовать описанные возможности
защиты информации Вы должны иметь либо
логин на локальном компьютере, либо на
Windows Server.

9.5.1.
Конфигурация

Здесь
описано, как установить систему, чтобы
использовать возможности обеспечения
безопасности информации программы
Rotor-Gene.

Для
использования возможности защиты
информации программы Rotor-Gene вы должны
установить программу с опцией «Force
Authentication through Windows NT Logon». При этом
программа запрашивает Windows домен о вашем
уровне доступа и правах, что необходимо
для обеспечения ответственности и
безопасности информации.

Не
используйте регистрацию как администратор
(Administrator)

Большинство
пользователей используют свои компьютеры
как администратор, без пароля. Хотя это
и удобно, но при этом невозможно
определить, кто использует компьютер.
В силу этого невозможно контролировать
ответственность и активизировать и
применять многие защитные меры программы
Rotor-Gene. Когда Вы входите как Administrator,
Вам разрешено использование всех
возможностей программы. Это гарантирует,
что пользователи, которые не нуждаются
в возможностях защиты, не будут неприятно
удивлены ограниченным доступом к опциям,
которые они использовали ранее.

Создание
новой учетной записи пользователя

Вы
должны создать учетную запись пользователя
для каждого пользователя программы.
Для этого повторите нижеследующие шаги
для создания каждой из нужных учетных
записей.

Для
создания нового пользователя нажмите
на старт, выберите Настройки
(Settings),
затем Панель
управления (Control
Panel) и дважды
кликните Пользователи
и пароли (Users
and
Passwords).

Кликните
кнопку Дополнительно
(Advanced),
затем кликните кнопку Дополнительно
(Advanced),
подсвеченную
ниже:

В
открывшемся окне выберите папку
пользователя. Кликните правой кнопкой
мыши в правой части окна и выберите
Новый
пользователь
(New
User).

Введите
имя пользователя и пароль. По умолчанию
учетная запись пользователя будет
создан с нормальными правами доступа.
Это значит, что он сможет использовать
программу, но не сможет устанавливать
новые программы или менять установки
системы.

Нажмите
кнопку Создать
(Create).
Теперь Вы сможете входить в сеть как
этот пользователь.

Присвоение
ролей каждому пользователю

Вы
должны сейчас присвоить роли каждому
пользователю. Доступ разделяется на
следующие области:

• Rotor-Gene
Operator
(Оператор) – Может работать с прибором
и производить операции, нужные для
выполнения анализа, но не может
генерировать отчёт или производить
анализ данных.

• Rotor-Gene
Analyst
(Аналитик) – Может анализировать данные
и генерировать отчёты, но не может
выполнять новые анализы.

• Rotor-Gene
Operator
and
Analyst
(Оператор и Аналитик) – Имеет возможности
выполнять обе роли.

• Administrator
(Администратор) – Может разблокировать
имена образцов и производить все операции
Аналитика и Оператора.

• None
– Доступ к программе запрещён.

Чтобы
назначать роли войдите в систему Windows
как Администратор или используйте
Rotor-Gene Logon окно для открытия программы
и ввода логина за один шаг:

Далее,
после того как программа открыта,
кликните в меню Security
(Безопасность).

В
первый раз, когда вы сделаете это,
программа Rotor-Gene сконфигурирует несколько
системных групп, которые будут
контролироваться в программе:

Нажмите
Yes.
После этого появится главное окошко
меню защиты. В верхней части окна будут
отображены все пользователи вашего
компьютера. Некоторые учетные записи
используются системой по умолчанию и
поэтому, они Вам будут незнакомы. Нижняя
панель показывает группы присвоенные
пользователям:

Чтобы
присвоить пользователю группу выберите
имя пользователя из списка. Верхняя
панель будет обновлена так, что она
будет показывать, какую роль пользователь
выполняет сейчас. Если пользователь не
принадлежит ни к одной группе, то он не
сможет пользоваться программой. В этом
примере (ниже) мы присваиваем пользователю
«matthew» доступ в группе RG
Analyst
(Аналитик) путём выбора группы из панели
слева с последующим нажатием кнопки
[>]. Для удаления Группы выберите ее и
нажмите кнопку [<].

В
приведенном примере мы зарегистрировались
как указанный пользователь. Поскольку
его группа «Аналитик», то при этом
недоступны опции меню Run
и
редактирования профиля Profile.
Можно открывать уже существующие файлы
и анализировать данные, как показано
на рисунке ниже. Внизу экрана в строке
состояния указан статус пользователя
STEW/matthew
– RG
Analyst,
чем объясняется недоступность некоторых
функций:

Зарегистрировавшись
вновь как Администратор, мы можем
присвоить пользователю Matthew
права RG
Operator
(Оператора) и снова открыть программу.
При этом будут отключены опции меню
анализа и отчетов (Analysis
и Reports)
и активирована опция запуска Run:

Строка
состояния показывает, что пользователь
«STEW/matthew» принадлежит к группе RG
Operator.
Если вы вошли в систему как Администратор
и убрали все группы для пользователя
Matthew,
то, когда вы откроете программу как
пользователь Matthew,
появится следующее сообщение:

9.5.2
Работа многих пользователей с одним
компьютером

Для
использования программы Rotor-Gene многими
пользователями вы должны создать учетные
записи пользователей, которые не имеют
доступа к программе Rotor-Gene. Входите в
Windows, используя эту учетную запись, чтобы
пользователи не могли анонимно иметь
доступ к Rotor-Gene 6000.

Используя
Rotor-Gene 6 Login, пользователи могут открыть
программу Rotor-Gene, используя свою учетную
запись:

Для
этого нужно ввести свое имя пользователя
и пароль:

Доменом
является либо компьютер, на который вы
входите, либо имя вашей локальной сети.
Обращайтесь к администратору сети,
которую Вы используете, чтобы узнать,
как следует регистрироваться

СОВЕТ:
Когда вы входите в программу Rotor-Gene, все
файлы пользователя будут доступны этому
пользователю. Вы можете таким образом
быть уверенными, что каждый пользователь
сохраняет файлы в своей собственной
области. Если настроить всё правильно,
то это является максимальной возможной
формой защиты.

СОВЕТ:
Каждый пользователь должен выходить
из программы Rotor-Gene после того, как его
анализ был закончен, чтобы предотвратить
возможность использования программы
и прибора под его именем другим
пользователями.

9.5.3
Записи проверок

Каждый
раз, когда файл сохраняется пользователем,
его детали записываются в Установках
в закладке Messages
(Сообщения),
как Security
Audit
Trail
Summary
и
Security
Audit
Trail
Detail:

Этим
можно пользоваться для проверки того,
кто изменил содержимое файла. Security Audit
Trail Detail содержит больше деталей, таких
как уникальный идентификатор пользователя.
Этот идентификатор важен, для того чтобы
избежать создания пользователем счета
с тем же самым именем, но на другом
компьютере и, таким образом выдавать
себя за другого пользователя. В этом
случае имя пользователя будет тем же
самым, но идентификатор учетной записи
будет другим.

Идентификатор
для
счёта
STEW/matthew, S-1-5-21-1287529892-… показан
в
Security Audit Trail Detail:

9.5.4
Подпись файла анализа / Signature

Все
записи проверок сохраняются внутри
файла Rotor-Gene. Существует вероятность
того, что этот файл был изменён
злоумышленниками, чтобы убрать следы
их действий. Наилучшей защитой против
таких повреждений является сохранение
файлов в безопасном месте. Это может
быть сделано установкой Windows учетных
записей с доступом только к определенным
файлам. Тем не менее, когда файлы хранятся
в области общего доступа, электронная
Подпись Анализа может давать дополнительный
уровень защиты против таких изменений.

Ниже
приведён снимок экрана закладки Security
(Защита),
находящейся в меню Settings
(Установки)
с файлом имеющим действительную подпись:

Подпись
– это длинное слово, которое генерируется
каждый раз, когда сохраняется файл, и
которое связано с содержимым файла.
Например, «517587770f3e2172ef9cc9bd0c36c081»
является подписью для этого файла. Если
вы теперь откроете файл анализа и
поменяете дату его проведения на 3 дня
раньше, то когда этот файл будет открыт
опять, появится следующее сообщение:

Следует
рассматривать с подозрением любой новый
файл с данными анализа, не имеющий
электронной подписи:

9.5.5
Блокировка образцов

При
диагностике важно быть уверенным, что
имена образцов по случайности или
умышленно не были изменены после того,
как оператор запустил выполнение
программы анализа. Чтобы обеспечить
это, программа Rotor-Gene предоставляет
механизм блокировки образцов. Имена
образцов могут быть заблокированы любым
пользователем, а разблокированы только
Администратором. Так как большинство
пользователей используют свои компьютеры
в режиме Администратора, то эта опция
будет использоваться ограничено, если
система защиты данных на этом компьютере
не была сконфигурирована надежно, как
было описано в предыдущих параграфах.

Совет:
Если Вы собираетесь заблокировать
образцы, то не используйте программу
как Администратор. Создайте счёта с
доступами RG Оператор и RG Аналитик и не
делайте пароль Администратора публично
доступным. Пользователям будет требоваться
Ваше разрешение, чтобы разблокировать
файлы, которые содержат ошибки.

Образцы
могут быть заблокированы до старта
выполнения анализа, когда вы используете
Усовершенствованный Мастер при нажатии
на кнопку Finish
and Lock Samples
(Закончить и Заблокировать Образцы):

Появится
следующее предупреждение. нажмите Yes

для подтверждения.

После
этого завершения редактирования образцов
в Редакторе Образцов все функции
редактора будут заблокированы:

Блокировка
Образцов может быть переключена из
одного состояния в другое внутри
Редактора Образцов, после того, как она
была установлена, но сделать это может
только Администратор.

Как
и ранее, пользователь может изменять
файл анализа и убирать флажок включения
блокировки. Тем не менее, если произошло
несанкционированное изменение файла
анализа, то это опять разрушит подпись
файла анализа, предупреждая вас о
нарушении.

9.5.6
Блокировка Шаблонов

При
диагностике может требоваться, чтобы
все анализы были выполнены путём запуска
специальных файлов шаблонов. Этот Шаблон
может быть сохранён на диске там, где
пользователи компьютерной сети не
смогут изменять данные. Пользователи
также имеют возможность выполнения их
собственных профайлов.

Учитывая
это, программа Rotor-Gene сохраняет в файле
анализа имя шаблона файла, который
выполнялся в данном анализе. Его имя и
расположение доступны через меню
Settings

в
окне
Other
Run Information
(Другая
Информация).

В
настоящее время невозможно создать
заблокированные для редактирования
файлы шаблонов через интерфейс программы
Rotor-Gene. Тем не менее, такие шаблоны как
используемый для Системы
Оптической Верификации Температуры
OTV
могут
быть заблокированы разработчиками,
если вы пошлёте запрос на адрес технической
поддержки support@.
Возможность
функционально заблокировать шаблон,
используя программу, намечена в будущих
выпусках программы.

10. Общие
функции, используемые несколькими
окнами.

10.1 Шаблоны анализа данных

Многие виды анализа
данных требуют операций по установке
порогов, установок нормализации графиков,
установок генотипов, и довольно часто
пользователи повторно используют те
же установки для анализа новых данных.

Функция создания
Шаблона Анализа данных позволяет
пользователю сохранить информацию об
этих установках отдельно и удобным
образом повторно использовать их для
анализа данных, при этом снижается
вероятность субъективной ошибки при
их установке.

В
настоящее время эта опция поддерживается
для Количественного анализа (Quantitation),
Анализа Кривых Плавления (Melt),
Аллельного Распознавания (Allelic
Discrimination),
Анализа Распределения (Scatter-analysis)
и Анализа по Конечной Точке (EndPoint).
Выполнив любой из этих видов анализа
можно экспортировать установки анализа
данных в файл с соответствующим
расширением (например, для анализа
Quantitation
– .QUT).
Чтобы воспользоваться шаблоном, надо
обратиться к меню с кнопками
Export
и
Import,
которое
обычно расположено примерно как на
приведенном рисунке.

10.2 Опция Открыть Второй Анализ

Во
время работы прибора для выполнения
анализа возможно одновременно открывать
и анализировать файлы ранее проведенных
анализов. При этом в меню второго окна
не активны опции New
(Создать Новый Анализ) и Start
Run.

Запустить новый анализ можно только из
первого окна, после того как выполняемый
анализ будет закончен.

10.3 Опции Масштабирования / Scale

Adjust
Scale
(Настройка
Масштаба Шкалы):
выведет окно, в котором Вы сможете ввести
масштаб вручную или выбрать его
интерактивно. Чтобы выбрать эту опцию,
просто нажмите правую кнопку мыши над
соответствующим экраном.

Auto-Scale
(Авто-Масштаб):
автоматически приводит шкалу в
соответствие с максимальными и
минимальными считываемыми данными.

Default
(По
умолчанию):
установит масштаб от 0 до 100 флуоресцентных
единиц.

10.4 Экспорт
графиков и данных

Более
широкий спектр опций экспорта графиков
теперь доступен. Вы можете выбирать
предпочтительный формат, а в меню справа
– размеры рисунка

Улучшены
и возможности экспорта данных в различных
форматах. Экспортировать данные анализа
и необработанные данные можно также
через меню File
/ Save
As

10.5 Символ Spanner
(Гаечный Ключ)

Щелкая
по изображению гаечного ключа, Вы
получаете доступ к набору инструментов,
упрощающих ручной анализ данных. Доступ
к этим инструментам также может быть
осуществлен при нажатии правой кнопки
мыши в соответствующих окнах.

3
перечисленные опции Масштабирования
описаны в предыдущем разделе.

Print
(Печать):
Эта
функция позволяет распечатать текущий
график, выведенный на экран.

Digital
Filter (Цифровой Фильтр):
Изменяет
текущий избранный цифровой фильтр на
графике. Цифровой фильтр выравнивает,
сглаживает данные с помощью скользящего
окна точек. Чтобы открыть это окно,
щёлкните правой кнопкой мыши над окном,
содержащим данные.

Show
Pinpointer
(Показать
точечный указа-тель): Открывает
окно с точными координатами текущей
позиции курсора на графике.

Select
Samples
(Выбрать
образцы):
Показывает только те образцы, которые
Вы поместили

в
область прямоугольника.

Zoom
(Увеличение):
С этой функцией Вы можете получить
увеличение изображения

в
некоторых областях экрана.

11.
Система Оптической Верификации
Температуры

(OTV)

Optical
Temperature
Verification
(OTV)
– система
Оптической Верификации Температуры –
это метод верификации температуры в
пробирке для прибора Rotor—Gene
6000.
Валидация температурного режима внутри
пробирки – очень важная процедура,
особенно для сертифицированных
лабораторий.

Функционирование
OTV—cистемы
основано
на использовании оптических свойств
трех различных термохроматических
жидких кристаллов (ТЖК), которые являются
точными индикаторами температуры. При
нагревании ТЖК меняет свои оптические
свойства, становясь из мутного прозрачным,
момент перехода свойств очень точно
соответствует определенной температуре
(50, 75 и 90°С). Поскольку ТЖК не флуоресцируют,
необходимо закрыть источник излучения
рассеивающей пластинкой (для Rotor—Gene
6000
– белой), чтобы точка перехода ТЖК была
зафиксирована оптической системой
прибора. ТЖК при температурах ниже
температуры перехода являются
непрозрачными и отражают свет, часть
которого рассеивается в направлении
детектора, увеличивая флуоресценцию.
Когда температура в пробирке достигает
температуры перехода ТЖК, он становится
прозрачным, свет от источника проходит
сквозь него в значительно большей мере,
чем отражается назад к детектору, что
вызывает снижение флуоресценции.
Изменение флуоресценции используется
для определения точности достижения
температуры каждого из ТЖК. Полученные
данные по температуре перехода сравнивают
с данными определяемой Rotor—Gene
6000
температуры, подтверждая таким образом,
что прибор соответствует своей
температурной спецификации.

Компоненты
набора OTV
включают:

Запечатанный
Gene-Disk
72 OTV-Ротор
(пробирки которого содержат ТЖК);

Флуоресцентную
заглушку (белую для Rotor—Gene
6000);

Профиль
термоциклирования и детекции;

CD
с серийным номером данного OTV-Ротора;

Служебную
записку 27;

Файл
с данными Калибровочного теста;

Программа
Rotor—Gene
6000
v
1.7, содержащая Мастер запуска OTV-
теста

Фиксирующее
кольцо Gene-Disk
72 Hub

Запуск
OTV-теста

Сначала
поместите рассеивающую пластинку в
лунку, ведущую к детектору, затем
поместите ОTV-Ротор
в Rotor—Gene
6000.

Выберите
шаблон
Temperature
Verification\OTV Rotor Run в
Мастере
Advanced.
Мастер
Старта запросит серийный номер ротора,
который Вы можете прочесть на этикетке
самого ротора.

Затем
будет запрошено имя файла для сохранения,
после чего начнется выполнение теста.
В процессе его выполнения будет проведена
серия тестов плавления, которая выявит
температурные характеристики
прибора.

При
завершении работы программа выдаст
сообщение о том, соответст-вуют ли
температурные характерис-тики данного
прибора специфи-кации. Если требуется
провести юстировку температуры,
пользо-ватель должен выбрать в окне
опцию Apply
Ajustment,
что позволит начать выполнение проце-дуры
верификации.

Если
прибор соответствует спецификации,
Пользователь может получить и распечатать
Отчет о проведенном тестировании,
который будет служить показателем
соответствия температурного режима
прибора.

12. Сокращения

BHQ (Black Hole
Quencher) Гаситель
типа «черной
дыры»

Comp.
Quantitation Сравнительный
количественный анализ

LCD Жидкокристаллический
дисплей

LED
(Light
Emitting
Diode) Светодиод

PMP
(Photomultiplier) Фотоэлектронумножитель

Quant.
Settings Количественные
установки

*.REA
(Rotor-Gene Archive file) Файл
Архива
Rotor-Gene

*.REX
(Rotor-Gene Experiment file) Файл
анализа
Rotor-Gene

RG Rotor—Gene

*.SMP
(Sample
file) Файл
образцов

Std.
Curve Кривая
Стандартов

Техническая
информация. Возникающие вопросы.

13. Разрешение
технических проблем

13.1 Log Archives (Файлы поиска и устранения
ошибок).

Для
разрешения проблем, возникших при работе
с Rotor—Gene,
сначала просмотрите ниже приведенные
ответы на часто встречающиеся вопросы.
В случае возникновения более сложных
проблем Вы можете связаться со службой
технической поддержки компании
«ИнтерЛабСервис»
по тел.
(495)-105-05-54,
фах
(495)-298-20-76,

e—mail:
info@pcr.ru.

Программное
обеспечение сохраняет неизменную копию
каждого файла анализа вместе с
диагностической информацией к нему в
директории Log
Archive.
Используя опции Help
(Помощь),
Send
Support
Email
(Послать письмо в службу поддержки)
Вы можете послать E-mail
со всей необходимой информацией по
проблемному файлу анализа непосредственно
специалистам в службу технической
поддержки (при
возможности подключения компьютера к
сети Internet).

13.2. Решение возможных проблем
при проведении анализа

Чтобы
решить проблемы с анализом, который
прошел не так, как ожидалось, вернитесь
к опции Profile
Editor
(Редактировать профиль)
и обсудите следующие вопросы:

13.2.1.
Стадия начальной денатурации.

Соответствуют
ли температура и время начальной
денатурации исполь-зуемому ферменту
Taq-полимеразе?

Проверьте
описание фермента, данное производителем.
Рекомендуемая температура равна 95ºС,
а время может варьировать от 2
до 15
минут в зависимости от используемого
фермента.

13.2.2.
Профиль циклической обработки.

Используются
ли объёмы реакционной смеси, равные 50
µl?

Rotor—Gene
калиброван для объёмов 20-25
µl,
в этом случае рекомендуемое время
денатурации в процессе циклической
обработки равно 15
секундам. Некоторые протоколы основаны
на реакциях в объёме 50
µl,
в таком случае мы рекомендуем увеличить
время денатурации в ходе циклирования
до 30
секунд.

Является
ли соответствующей температура
денатурации?

Большинство
двухспиральных ДНК
плавятся при 95ºС.
В некоторых случаях температуры от 90ºС
до 94ºС
не могут полностью денатурировать ДНК.
В случае не полностью денатурированной
ДНК
доступность ее для праймеров и зондов
может снижаться и, следовательно, может
уменьшаться эффективность реакции в
ходе анализа.

Является
ли соответствующим время денатурации?

15
– 20
секунд обычно достаточно, чтобы
денатурировать ампликон, однако для
более длинных продуктов может быть
необходимым до 30
секунд.
Время денатурации в 60
секунд обычно не является необходимым.

Являются
ли соответствующими температура и время
отжига?

Проверьте
Тm
праймеров
и зондов. Время отжига для Sybr
Green I
колеблется от 20
до 35
секунд. При использовании зондов с
двойной меткой часто проводят двухшаговую
обработку (циклирование по двум шагам),
где стадии отжига и элонгации совмещены
(комбинированы). В этом случае стадия
отжига/элонгации занимает от 45
до 60
секунд, а температура обычно равна 60ºС.
Для FRET-зондов
стадия отжига длится обычно от 20
до 30
секунд.

Являются
ли соответствующими температура и время
элонгации?

Проверьте
рекомендации производителя Taq-полимеразы.
Для продукта, меньшего чем 300
bp,
рекомендуемое время от 15
до
30
секунд.

На
какой стадии нужно проводить детекцию?

Для
Sybr
Green I детекцию
проводят при температуре 72ºС.
Ожидается, что при этой температуре
большая часть ДНК
является двухспиральной. Как уже было
упомянуто выше, для зондов с двойной
меткой часто проводят двухшаговый
анализ. Поэтому детекцию нужно выполнять
на стадии отжига/элонгации. Для
FRET-анализа
детекцию проводят на стадии отжига.
Если существуют сомнения относительно
соответствующей точки для детекции
данных, то данные можно получать на
нескольких стадиях для сравнения. Если
на экране совсем не видно никаких
первичных данных, возвращайтесь в
«Редактирование профиля» и проверьте,
была ли назначена детекция хотя бы в
одной точке.

13.2.3
Анализ кривой плавления.

Нужно
ли до запуска кривой плавления ввести
фазу удержания при той же температуре,
что и начало плавления?
Если до запуска кривой плавления не
была проведена фаза удержания, то
результаты анализа кривой плавления
могут претерпевать крутой подъём во
время нескольких первых циклов, делая
фактический пик плавления едва заметным.

Для
кривых плавления Sybr Green I; доходила ли
кривая плавления до 99ºС?

Некоторые
ампликоны плавятся при температуре
выше чем 90ºС.
Можно не получить ожидаемый пик плавления,
поскольку ДНК
не расплавилась.

13.2.4.
Установки параметра Gain
(Усиление).

Были
ли выбраны соответствующие установки
Gain?

В
некоторых случаях можно наблюдать, что
кривые первичных данных выходят за
пределы шкалы флуоресценции, в результате
появляется прямая линия при флуоресценции
равной 100.
Хотя количественный анализ большинства
данных все же может быть произведён,
следует уменьшить значение параметра
Gain
(Усиление)
до установочных величин, когда первичные
данные не выходят за пределы шкалы.

В
некоторых случаях флуоресценция начинает
превосходить масштаб, начиная с первого
цикла. Это происходит потому, что была
выбрана слишком высокое значение
параметра Gain.
При этом данные не несут информации об
амплификации и не позволяют получить
результаты.

Если
в начале кривой плавления наблюдается
прямая линия при флуоресценции 100,
то кривая плавления должна быть повторно
измерена с использованием более низкого
значения Gain.
Нет необходимости повторно запускать
амплификацию, до определенного предела
Sybr
Green I
или FRET-зонды
могут быть использованы повторно для
измерения кривых плавления.

Были
ли выбраны соответствующие Quantitation
Settings (Установки количественного анализа)?

В
некоторых случаях отмечают, что первичные
данные показывают характерный для
амплификации рост флуоресценции, но на
экране количественного анализа не видно
никаких результатов. Установка для
параметра NTC
Threshold
значения 0
в меню Quantitation
Settings
позволит увидеть все данные. Установка
Quantitation
Settings
может
применяться, чтобы исключить незначительные
изменения флуоресценции в результате
деградации зонда или других эффектов,
относящихся к зонду, которые отражают
не истинную амплификацию, а скорее линию
фона с постоянным наклоном.

Если
количественные кривые могут быть
исключены при минимальных значениях
Quantitation
Settings,
то значение параметра Gain
при следующем запуске следует повысить.
Примечание: значение Gain
не влияет на фактические данные, ожидаемая
кратность увеличения сигнала (форма
кривой) будет аналогичной.

13.2.5.
General Setup (Состояние общих установок)

Были
ли выбраны подходящие установки для
Rotor—Gene?

Чтобы
проверить это, выберите меню File,
затем Setup
(Установки)
и пометьте соответствующие ячейки.
Если Вы сомневаетесь, что означает
каждая ячейка или если установка
недоступна, пожалуйста, обратитесь к
своему дистрибьютору.

Был
ли выбран соответствующий ротор при
запуске?

До
запуска выполнения программы анализа
прибором убедитесь, что был верно выбран
либо 36-луночный,
либо 72-луночный
ротор в соответствии с типом ротора,
установленного в Rotor—Gene.
Неверный выбор типа ротора может привести
либо к потере данных о каждом втором
образце (если в прибор установлен
72-луночный
ротор, а выбран 36-луночный
ротор), либо к неправильному определению
позиций образцов (установлен 36-луночный
ротор, а указан 72-луночный).

Какая
версия программного обеспечения
используется для Rotor—Gene?

Развитие
программного обеспечения для Rotor—Gene
происходит постоянно и новые версии
можно свободно загрузить с веб-страницы
Corbett
Research
().
Убедитесь, что загружена и используется
последняя версия.

13.2.6.
Установки.

Если
образцы не детектируются, проверьте
также установки каналов. Удостоверьтесь,
что данные были получены с помощью
соответствующих фильтров возбуждения
и детекции. Это особенно важно, когда
установлены определяемые пользователем
(а не стандартные) параметры фильтров.

Что,
если все выше упомянутые условия были
выполнены правильно, но результаты не
похожи на ожидаемые или анализ не
работает вовсе?

В
области ограниченного пользования на
нашей домашней странице существует
файл, который называется «Краткое
руководство по ПЦР в режиме реального
времени». Там предлагаются мероприятия,
как оптимизировать реакции с Sybr
Green I,
с зондами с двойной меткой или FRET-зондами.
В целом, ожидаемая кратность прироста
флуоресценции в реакции Sybr
Green I
колеблется от 5
до 50
раз, а для зондов с двойной меткой – от
2
до 10
раз.

14.
Математическое приложение (Методы
вычислений)

Этот
раздел описывает математические методы,
используемые для вычислений

в
программе.

Расчет
концентраций
при количественном анализе

Расчет
концентраций выполняется с помощью
метода линейной регрессии, используется
простая модель с известными значениями
логарифма концентрации (х)

и
экспериментальными значениями Ct
(y).
Логарифмы
концентрации и значения Ct
по модели должны быть связаны уравнением
y
= mx
+ b

Доверительные
интервалы для рассчитанных концентраций

Используется
следующий 100% (1-α) доверительный интервал
для оценки новых значений х0 по кривой
стандартов:

Это
выражение для доверительного интервала
концентрации одного тестируемого
образца (uknown).

Предположим,
теперь мы имеем еще к наблюдений для
x=x0,
и обозначим их среднее как
,
тогда

и,
аналогично рассмотренному выше,

Эта
формула определяет доверительный
интервал для концентраций реплик
тестируемых (неизвестных) образцов.

Для
оценки значений образцов-стандартов
используется более узкий доверительный
интервал:

Доверительный
интервал для значений Ct

Предполагая,
что ошибка среднего для Ct
реплик – линейна и нормально распределена,
используем односторонний t-доверительный
интервал. Пусть среднее значение Сt

.

Тогда
100(1- α)%
доверительный интервал для величины
Ct: